袁明洲，袁欣欣，林 瑶，蔡 晶

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学修园临床医学院，福建 福州 350122）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是世界第二大神经退行性疾病［1］。中脑部位的黑质致密部多巴胺神经元（dopaminergic neurons，DN）的进行性损伤是造成PD 的主要病理变化。而氧化应激的发生可导致机体出现氧化-还原失衡，进而导致生成大量活性氧，这是导致中脑黑质DN 损害的重要原因［2-3］。在临床中往往采用口服左旋多巴，即美多芭外源性补充多巴胺进行治疗。但单一长期用药易引起较多不良反应，因此可考虑联合用药。核转录因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是一种氧化还原的关键调节因子［4］。大部分抗氧化细胞产生的保护蛋白表达受Nrf2 信号蛋白的调控。在PD 患者中，Nrf2 及下游蛋白醌氧化还原酶-1（NQO-1）激活可有效保护细胞免受氧化应激损伤［5］。β-谷甾醇（β-sitosterol）是一种重要的植物甾醇，广泛存在于如肉苁蓉、半夏等中药植物中，具有显著的抗氧化作用［6］，β-谷甾醇还可在不影响线粒体外膜的情况下，使线粒体膜电位及ATP 含量增加，起到缓解神经退行性疾病的作用［7］。但β-谷甾醇能否改善PD 大鼠脑氧化应激损伤尚有待研究。本实验拟通过构建PD 动物模型验证β-谷甾醇对大脑氧化应激的保护作用，进一步探究是否通过Nrf2 及下游蛋白Nrf2、HO-1、NQO-1 发挥作用，为β-谷甾醇对PD 氧化应激的保护作用提供实验依据。

1 实验材料

1.1实验动物 2 月龄SPF 级SD 雄性大鼠40 只，体质量为（200±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（浙）2019-0002，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。饲养于福建中医药大学实验动物中心。饲养条件：室温（22±2）℃，湿度（60±5）%，饲喂标准大鼠饲料，自由饮水和取食。

1.2实验试剂 β-谷甾醇（货号：S1270）、鱼藤酮（货号：R8875）均购自美国Sigma 公司；美多芭（货号：H10930198）购自上海罗氏制药有限公司；鱼藤酮（货号：A8007）、葵花油乳化液（货号：H8923）均购自美国Sigma 公司；丙二醛（MDA）测试盒（货号：A003-1）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（货号：A001-1）均购自南京建成生物工程研究所；SDSPAGE 凝胶配置试剂盒（货号：P0012A）购自上海碧云天生物技术研究所；ECL 化学发光检测试剂盒（货号：B500022）购自美国Bio-Rad 公司；PVDF 膜（货号：W0162）购自北京索莱宝科技有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒（货号：PT0001）购自福建迈新技术有限公司。

1.3实验仪器 电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；倒置显微镜（上海尼康仪器有限公司）；光学显微镜（上海徕卡仪器有限公司）；石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司）；石蜡包埋机（孝感亚光医用电子技术公司）；电泳仪（上海伯乐生命医学医学产品公司）；转膜仪（上海伯乐生命医学产品公司）；化学发光成像仪（上海伯乐生命医学产品公司）。

2 实验方法

2.1分组与造模 将40 只大鼠采用随机数字表法分为正常组、模型组、治疗组和美多芭组，每组10只。模型组、治疗组及美多芭组大鼠采用鱼藤酮葵花油乳液（将鱼藤酮、葵花油乳液按1.5∶1 比例混合均匀）颈背部皮下注射，每只大鼠注射剂量为1.5 mg/（kg·d），连续注射14 d［8］。根据VOITENKO 等［9］行为学标准，得分2～8 分者为合格的PD 模型大鼠。PD 模型大鼠表现为自主行为减少，拒捕行为减弱，弓背向上抬高，单侧斜卧，行走困难。正常组大鼠正常饮食，不予处理。

2.2给药方法 以60 mg/（kg·d）β-谷甾醇的给药剂量对大鼠进行灌胃［10］，美多芭组予5 mg/（kg·d）美多芭混悬液灌胃，正常组、模型组大鼠采用生理盐水灌胃。以上各组给药均为每天1次，连续14 d。

2.3观察指标

2.3.1大鼠一般情况 每天观察4 组大鼠进食、饮水、活动、精神情况，并做好记录。

2.3.2血清SOD、MDA 含量 造模、干预成功后，所有大鼠处死留取血液，离心后取上层血清，采用SOD、MDA 试剂检测4 组大鼠血清中SOD、MDA含量。

2.3.3脑黑质组织TH、Nrf2 阳性细胞率 取4 组大鼠脑黑质组织于多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋后切片。切片烘干脱蜡后进行抗原修复，再用内源性过氧化物酶孵育10 min，PBS 清洗，非特异性染色阻断剂孵育10 min，一抗4 ℃孵育过夜，第2 天烘箱37 ℃复温30 min，二抗孵育10 min，PBS 清洗，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶孵育10 min，最后DAB 染色。200 倍显微镜下观察，以棕黄色或淡黄色颗粒染色为阳性表达。每张切片随机选取5 个视野，应用Image Plus 6.0 软件分析图像，读取TH、Nrf2 阳性反应细胞率，取平均值。

2.3.4脑黑质组织Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表达量 取相应脑组织50 mg，BCA 法测定蛋白浓度。经过蛋白变性、SDS-PAGE 电泳、湿转转膜后，5%脱脂牛奶封闭1 h。加一抗 Nrf2（1∶1000）、HO-1（1∶1 000）、NQO-1（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000），4 ℃摇床过夜。TBST 洗涤，加入二抗稀释液（1∶5 000），室温孵育2 h，TBST 洗涤，ECL 显影并成像，Image Lab 4.0 软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与β-actin 条带灰度值的比值做为目的蛋白相对表达量。

2.4统计学方法 数据采用SPSS 24.0 软件进行分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析；各组间的两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结 果

3.14 组一般情况比较 造模后正常组大鼠活动无差异；模型组大鼠造模7 d 后出现皮毛变黄，自发活动减少，尾部僵硬，弓背向上抬高，行走困难等帕金森症状。治疗组和美多芭组大鼠一般情况有较为明显改善，皮毛较光亮，行动不便情况也有所好转。

3.24 组血清SOD、MDA 含量比较 与正常组比较，模型组大鼠血清中SOD 含量降低，MDA 含量升高（P＜0.05）。与模型组比较，治疗组和美多芭组SOD 含量升高，MDA 水平降低（P＜0.05）。见表1。

表1 4 组血清中SOD、MDA 含量比较（±s） μg/moL

表1 4 组血清中SOD、MDA 含量比较（±s） μg/moL

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

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3.34 组脑黑质组织TH、Nrf2 阳性细胞表达情况比较 与正常组比较，模型组TH、Nrf2 阳性细胞率均减少（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组和美多芭组TH、Nrf2 阳性细胞率均增加（P＜0.05）。见图1-2、表2。

图1 4 组脑黑质TH 阳性细胞表达情况（免疫组化，×200）

图2 4 组脑黑质区Nrf2 阳性细胞表达情况（免疫组化，×200）

表2 4 组脑黑质TH、Nrf2 阳性细胞率比较（±s）

表2 4 组脑黑质TH、Nrf2 阳性细胞率比较（±s）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

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3.44 组脑组织Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表达情况 见图3、表3。

图3 4 组脑组织Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白条带图

表3 4 组脑组织Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表达水平比较（±s）

表3 4 组脑组织Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表达水平比较（±s）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

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4 讨 论

PD 是高发于老年人的慢性神经退行性疾病，其主要病理特征为中脑DN 凋亡导致其数目减少。造成DN 凋亡的机制尚未完全明确，但氧化应激损伤起到了十分重要的作用。氧化应激造成脑内氧化与还原能力的失衡，增多的氧化产物损害中枢组织和细胞的功能，引发PD 症状［11］。因此寻找有效的抗氧化药物成为PD 治疗的有效手段。

β-谷甾醇是一种广泛存在于中草药植物根、茎、叶中的植物甾醇，具有多种生物学活性，可抑制肿瘤细胞增殖、抗衰老、修复损伤和调节血糖等多种作用［12-14］。尤其引人注意的是，β-谷甾醇在如阿尔茨海默病等神经退行性疾病中的作用。SHI等［15］的研究证实，β-谷甾醇可抑制葡萄糖氧化酶诱导的氧化应激损伤及脂质过氧化反应，从而改善因脑脂质过氧化引起的阿尔茨海默病。本实验应用β-谷甾醇干预后，治疗组大鼠自主行为、拒捕行为增多，弓背向上抬高、行动困难等PD 相关症状有所改善。TH 阳性细胞数反应脑内存活的多巴胺神经元的数量，本实验结果显示，运用β-谷甾醇治疗后，治疗组TH 阳性细胞数与模型组比较有所增加，说明β-谷甾醇可有效保护PD 大鼠多巴胺神经元细胞。

SOD 是机体重要的抗氧化酶蛋白质，可有效去除氧自由基，起到重要的维持氧化和抗氧化平衡的作用。但在PD 患者中，SOD 含量往往降低［16］。实验研究证实，PD 小鼠模型脑部病变区域MDA 含量增加，而MDA 是重要的脂质过氧化指标［17］。YIN等［18］在急性肝损伤小鼠模型中发现，β-谷甾醇可增高小鼠SOD、降低MDA 的表达，起到较好的抗氧化应激作用。本研究采用β-谷甾醇干预PD 大鼠模型，大鼠血清中SOD 含量高于模型组，MDA 浓度低于模型组。提示β-谷甾醇在PD 中亦有较好的抗氧化应激作用。

为进一步明确β-谷甾醇在PD 中的抗氧化作用机制，本研究采用免疫组化检测脑黑质中Nrf2 表达，Western blot检测PD大鼠脑组织中的Nrf2、HO-1、NQO-1 的蛋白表达情况。Nrf2 是机体内重要的抗氧化调节因子［19］，当机体细胞出现氧化应激损伤时，磷酸化的Nrf2 进入细胞核并激活下游抗氧化基因HO-1 和NQO-1 的表达，使HO-1 和NQO-1 蛋白含量上调。HO-1 的抗氧化作用体现在可阻止游离胆红素参与氧化应激反应及能够激活具有抗氧化作用的胆红素［20］，而NQO-1 可抑制ROS 的生成［21］，两者共同发挥抗氧化损伤能力和保护细胞作用［22］。基于此，Nrf2 及下游蛋白HO-1 和NQO-1 可在多种由氧化应激损伤导致的疾病中起到保护作用［23］。本实验结果显示，与正常组比较，模型组脑黑质中Nrf2 阳性细胞数较正常组降低，β-谷甾醇治疗后，Nrf2 阳性细胞数有所增加。同时，Western blot 结果显示，模型组Nrf2、HO-1、NQO-1 表达较正常组降低，而在β-谷甾醇干预后，Nrf2、HO-1、NQO-1 表达较模型组升高，说明β-谷甾醇可通过上调Nrf2 并激活其下游基因发挥抗氧化应激损伤的作用。

综上，β-谷甾醇可能通过Nrf2/HO-1 信号通路起到有效去除氧自由基、降低脂质过氧化的作用，一定程度抑制PD 大鼠脑组织中氧化应激损伤，从而发挥保护黑质神经元的作用。