豆腐柴果实中黄酮类成分的电化学检测

2024-05-16王永泰高集源王双凯刘召娜

广东蚕业 2024年3期

王永泰　王　炎　杨　朝　高集源　王双凯　刘召娜

豆腐柴果实中黄酮类成分的电化学检测

王永泰王炎杨朝高集源王双凯刘召娜

（西安培华学院医学院陕西西安710125）

豆腐柴的根、茎、叶、果实中不仅含有大量的果胶、粗纤维、蛋白质，而且含有丰富的矿物质和黄酮类物质，具有很高的药用价值。目前对豆腐柴的研究主要集中在其根、茎、叶上，而对其果实的研究较少。文章采用乙醇回流、石油醚萃取的方法对豆腐柴果实中的黄酮类成分进行提取，通过电化学法对所提取的黄酮类成分进行检测。

豆腐柴；果实；总黄酮；电化学法；检测

豆腐柴（Turcz.）全身都是宝，其根、茎、叶、果实都具有较好的开发利用价值。豆腐柴叶颜色翠绿，叶汁凝胶持水力强、黏弹性好[1]，含有大量的粗纤维、果胶、维生素C和氨基酸等[2-3]，可被制作成柴豆腐[4]，具有较高的营养价值。除此之外，豆腐柴茎叶提取物有抗炎、镇痛、改善微循环、保护坐骨神经和治疗软组织损伤的作用[5-6]。如以豆腐柴为主要原料制备的复方豆腐柴搽剂具有明显的消肿、止痛、抗炎和增强免疫的功能。在广西，豆腐柴已被制作成健骨注射液，用来治疗肥大性脊椎炎、风湿性关节炎、肩周炎等多种骨科疾病。豆腐柴的这些功能可能和其所含有的黄酮类成分有关[7-8]。黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，具有降压、抗癌、抗炎以及降血糖等药理活性。

目前对于豆腐柴中的黄酮类成分的研究主要集中在其根、茎、叶上[9]，而豆腐柴果实中的活性成分及其药理作用还没有被很好地挖掘出来。因此，本研究对豆腐柴果实中的黄酮类成分进行提取和检测，挖掘豆腐柴果实的药用价值，为合理地开发利用豆腐柴资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：豆腐柴果实，2022年7月采于陕西省。

化学试剂：无水乙醇、石油醚、氢氧化钠、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、亚硝酸钠、硝酸铝、盐酸、浓盐酸、锌粉、镁粉等，均为分析纯。

1.2 仪器设备

提取和检测所用仪器设备：高速万能粉碎机、旋转蒸发仪、循环水式多用真空泵、电化学分析仪（CHI660）、调温电热套、金相砂纸、超声清洗仪、超纯水机。

1.3 试剂配制

芦丁标准溶液配制：称取干燥至恒重的芦丁标准品0.02 g置于小烧杯中，用体积分数为75%的乙醇进行溶解，定容至50 mL容量瓶中，得到芦丁标准溶液（4 ℃冰箱避光保存）。

pH为2的磷酸盐缓冲液配制：称取磷酸58.5 g、磷酸二氢钠48 g，在充分搅拌的情况下，加水定容至1 L得到pH为2的磷酸盐缓冲液。

1.4 实验方法

1.4.1 豆腐柴果实中总黄酮提取液的制备

将新鲜采摘的豆腐柴果实洗净、晾晒、烘干（50 ℃）至恒重，用粉碎机粉碎，将粉碎后的豆腐柴粉末收集备用。称取豆腐柴果实粉末15.00 g，加入体积分数为75%的乙醇150 mL，搭建回流装置，加热回流提取1 h。然后进行抽滤，收集滤液。将滤渣再加入圆底烧瓶中，加入体积分数为75%的乙醇150 mL，用上述同样方法加热回流提取1 h，抽滤，将两次滤液合并，弃去滤渣。将合并的滤液倒入500 mL圆底烧瓶中，放置在旋转蒸发仪上进行提取凝缩至90 mL左右，停止加热。再用石油醚进行萃取，静止10 min使其分层，下端液体放出，则得到豆腐柴果实总黄酮提取液。将提取液转入100 mL容量瓶中，并用体积分数为60%的乙醇进行定容，保存备用（4 ℃冰箱进行保存）。

1.4.2 显色反应

为了确定提取液中是否含有黄酮类成分，利用盐酸镁粉反应对本提取液进行检测。这一反应是鉴定黄酮类化合物最常用的显色反应。该方法步骤是先加入镁粉（或锌粉）振摇，然后再加入浓盐酸。大多数黄酮类化合物、类黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇反应后会显现橙红色至紫红色，少数显现紫色或蓝色。当其B环有羟基（—OH）或甲氧基（—OCH3）取代时，颜色会变深。取5 mL豆腐柴提取液放入试管中，用药匙取半勺镁粉加入其中，轻微振摇，再加入少许浓盐酸，观察提取液的颜色变化。

1.4.3 电化学法检测芦丁标准曲线建立

电化学实验采用三电极体系，以玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极和铂电极作为对电极。用金相砂纸对玻碳电极表面进行打磨抛光处理，再进行超声清洗3 min，自然晾干。取50 mL磷酸盐缓冲液（pH=2），倒入电解池中。将三电极体系电极插入电解池中（在电解液表面以下1 cm）。取上述芦丁标准溶液以每30 μL的梯度加入电解液中（0、30、60、90、120、150、180 μL），观察电极产生的氧化还原峰电流强度。以峰电流值（A）为纵坐标，以芦丁标准品的质量浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。

2 实验结果与讨论

2.1 电化学法检测芦丁标准曲线的建立

芦丁作为黄酮类物质的标准品，本实验将利用电化学法建立检测芦丁的标准曲线[10-12]。电化学法是利用玻碳电极作为工作电极，以磷酸盐溶液作为缓冲液，通过加入芦丁标准品进行电化学检测。芦丁的化学式如图1，它含有5-羟基黄酮和邻位二元醇结构，可以与不同的金属离子形成特定位点的复合物，芦丁含有电活性基团，具有良好的电化学信号，这是因为芦丁的B环的羟基能够发生氧化反应，生成苯醌式结构[10]。芦丁标准品在玻碳电极上会有良好电化学信号。

图1　芦丁B环上的3´和4´位置羟基发生的氧化反应

在pH为2的磷酸盐缓冲溶液中，利用玻碳电极作为工作电极建立芦丁标准品检测的标准曲线。如图2所示，扫描电位区间是0～0.8 V，扫描速度为0.05 V/s。可以观察到在电位0.5～0.6 V时有一对可逆的氧化还原峰。在0.55 V处出现一个较好的还原峰，在0.57 V处出现一个氧化峰，对应着芦丁的氧化还原反应。随着芦丁的质量浓度在2.4×10-4～14.4×10-4mg/mL范围变化，其位于0.55 V处的还原峰电流不断增大，位于0.57 V的氧化峰电流也不断增大。这说明芦丁在玻碳电极上的氧化还原信号随着其质量浓度的增大而增大，具有良好的响应信号。将不同质量浓度下的氧化峰电流与质量浓度进行数据分析总结，可以得到表1。

图2　玻碳电极在含有一系列不同质量浓度芦丁标准品的磷酸盐缓冲液（pH=2）中的循环伏安图

（注：扫描速度为0.05 V/s）

表1　不同质量浓度的芦丁标准品产生的氧化峰相对电流

根据芦丁标准品质量浓度与其在玻碳电极上产生的氧化峰电流的关系，绘制出标准曲线如图3所示，测定芦丁标准品线性回归方程为（μA）=0.183 3（10-4mg/mL）+0.99，2=0.991 5。芦丁标准品质量浓度在2.4×10-4～14.4×10-4mg/mL范围时，氧化峰电流与其质量浓度呈现良好的线性关系。因此，可以利用该线性关系对豆腐柴果实中的黄酮类成分进行检测。

图3　玻碳电极检测芦丁标准品的氧化峰相对电流与质量浓度之间的线性关系

2.2 豆腐柴果实中黄酮类成分的检测

2.2.1 显色反应

本实验豆腐柴果实中的黄酮类成分是采用加热回流法进行提取的。为了确定提取液中是否含有黄酮类成分，首先利用盐酸镁粉反应对提取液进行检测，取5 mL豆腐柴果实总黄酮提取液放入试管中，用药匙取半勺镁粉加入，轻微振摇，再加入少许浓盐酸，溶液由黄色变成红色（见图4），证明该提取液中含有黄酮类成分。然后，再进一步对提取液中的黄酮类成分进行检测。

图4　豆腐柴果实提取物的盐酸镁粉显色反应

2.2.2 电化学法检测豆腐柴果实提取液中黄酮类成分的含量

取10 μL豆腐柴果实提取液，加到50 mL磷酸盐缓冲液中，利用玻碳电极在相同的条件下进行电化学实验测试，得到氧化峰电流为3.1 μA，根据芦丁标准曲线计算得出50 mL磷酸盐缓冲液中黄酮类成分的质量浓度为11.5×10-4mg/mL，通过计算可得15 g豆腐柴果实中黄酮类成分的质量分数为3.8%。

为了验证该实验方法是否准确，实验中对样品进行了电化学法的加标回收实验。取一定量的豆腐柴果实提取液，加入一定量的芦丁标准品溶液，摇匀，按样品测定方法测定，计算回收率（= 4），结果平均回收率为100.9%，表明该方法较准确可靠。

3 结论

为了检测豆腐柴果实中黄酮类成分的含量，本研究采用加热回流提取法对豆腐柴果实中黄酮类成分进行提取，并利用电化学法对豆腐柴果实中黄酮类成分进行检测。芦丁标准品质量浓度在2.4×10-4～14.4×10-4mg/mL范围时，电化学信号与其质量浓度之间呈现良好的线性关系。因此，利用该线性关系对豆腐柴果实中的黄酮类成分进行检测，结果表明豆腐柴果实中黄酮类成分的质量分数为3.8%。电化学法具有成本低、简便、快速的优点，可以用于黄酮类物质的检测。

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