■ 郑国建 叶寅颖 雷 涛 曹 莹

（1.上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233；2.上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

血根碱和白屈菜红碱是天然存在的苯骈菲啶类生物碱[1]，在博落回中含量丰富。饲粮中添加血根碱可以提高奶山羊产奶量，改善机体的抗氧化和免疫功能[2]，可以缓解断奶仔猪免疫应激导致的生长性能下降，增强免疫能力，并在一定程度上改善小肠黏膜形态结构，改善断奶仔猪的肠道健康[3]。血根碱还具有对人宫颈癌耐药细胞增殖的抑制作用[4]。白屈菜红碱具有抗肿瘤、抗菌和抗炎等药理活性[1]，能够抑制人高转移性肝癌细胞系MHCC97-H 的生长、侵袭和迁移能力[5]。血根碱和白屈菜红碱还具有抗白假丝酵母菌、新型隐球菌的作用[6]。

血根碱和白屈菜红碱主要是以博落回散的形式添加到饲料中。中华人民共和国农业农村部公告第246 号收录了博落回散为药物饲料添加剂，并规定了使用范围和使用限量。

目前，测定血根碱和白屈菜红碱的常用方法包括毛细管电泳法[7-8]、高效液相色谱法[9-10]和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[11-12]。按照农业农村部公告第246 号规定，饲料中博落回散（规格为100 g：0.375 g）的添加量为0.2～0.6 g/kg。采用罗忠勇等[13]的方法测定博落回散（规格为100 g：0.375 g）中血根碱和白屈菜红碱含量为0.6～1.4 g/kg，由此可知，饲料中血根碱和白屈菜红碱的含量为0.1～0.8 mg/kg。而毛细管电泳法和高效液相色谱法的检出限只能达到50 mg/kg 左右[7-10]，主要用于天然产物[7-8]和药剂[10]等方面的研究，无法满足饲料中血根碱和白屈菜红碱的检测需要。同时，饲料基质相对复杂，而液相色谱-串联质谱法具有较强的抗干扰能力[11-12]， 因此，本研究建立了一种液相色谱-串联质谱法检测饲料中血根碱和白屈菜红碱的方法，以期更加准确地测量饲料中血根碱和白屈菜红碱的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

血根碱标准品、白屈菜红碱标准品，纯度≥98%，购于上海诗丹德标准技术服务有限公司；甲酸、甲醇、乙腈为色谱纯，购于Fisher Scientific；盐酸、乙醇、冰醋酸为化学纯，购于国药化学试剂有限公司；Agilent SCX（200 mg，6 mL）强阳离子交换柱，购于安捷伦公司；Waters MCX（60 mg，3 mL）混合型阳离子交换柱、HLB 固相萃取柱（500 mg，6 mL）、QuEChERS 净化包1[50 mg PSA（乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶），100 mg C18，100 mg MgSO4]、QuEChERS 净化包2（50 mg PSA，50 mg C18，100 mg MgSO4）、QuEChERS净化包3[25 mg GCB（石墨化碳黑），50 mg PSA，50 mg C18，150 mg MgSO4]，购于沃特斯公司；超纯水由Millipore Milli-Q超纯水仪生产。

1.2 仪器与设备

Waters XEVO TQXS 液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI），美国Waters公司；Wiggens Votex 3000 涡旋振荡仪，德国WIGGENS 公司；超声波清洗机，上海科导超声仪器有限公司；Eppendorf 5804离心机，德国艾本德公司；Millipore Milli-Q 超纯水，美国密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

Waters BEH C182.1 mm ×50 mm，1.7 μm。流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为乙腈溶液，梯度洗脱：0～1 min，10% B保持不变；1～6 min，10% B线性变化至100% B；6～8 min，100% B保持不变；8.1 min变化至10% B，平衡2 min。柱温：35 ℃。流速：0.3 mL/min。进样量：2 µL。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）为正电离模式，毛细管电压3.0 kV，锥孔电压30 V，干燥气温度400 ℃，干燥气流速800 L/h，锥孔反吹气流速150 L/h，源温150 ℃，离子对、碰撞能量见表1。

表1 质谱参数

1.3.3 标准溶液的配制

1.3.3.1 标准储备溶液（0.5 mg/mL）

称取血根碱和白屈菜红碱标准品各50 mg（精确至0.1 mg），分别置于100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混匀。

1.3.3.2 标准中间溶液（1 µg/mL）

分别准确移取0.2 mL标准储备溶液于100 mL容量瓶中，用0.2%盐酸乙腈溶液稀释并定容，混匀。

1.3.3.3 标准系列溶液

分别准确移取适量标准中间溶液于容量瓶中，用0.2%盐酸乙腈溶液稀释并定容，混匀，配制成质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100 ng/mL标准系列溶液。

1.4 样品处理

1.4.1 提取

平行进行两个试验。称取试样（添加剂预混合饲料、浓缩饲料、配合饲料、精料补充料和水产饲料）2 g（精确至0.1 mg），置于50 mL离心管中，加入15 mL盐酸乙腈溶液，涡旋，超声提取20 min，9 000 r/min 离心5 min，将上清液转移至50 mL 容量瓶中。重复提取2 次，合并上清液，用盐酸乙腈溶液定容，混匀，备用。

1.4.2 净化

吸取备用液约3 mL 过固相萃取柱及微孔滤膜，弃去约1 mL流出液，收集续滤液，待测。

2 结果与分析

2.1 监测离子对的选择及质谱条件的确定

血根碱、白屈菜红碱含有带正电的氨离子，在质谱分析中可使用正离子模式。用浓度为0.1 µg/mL 的血根碱、白屈菜红碱标准溶液进行质谱扫描，按照响应最高选定2 个子离子进行监测，质谱优化条件参数见表1，与钟明等[14]的报道结果一致。

2.2 色谱柱的确定

血根碱和白屈菜红碱为中等极性化合物，故采用C18色谱柱进行分离。以0.1%甲酸溶液和乙腈溶液为流动相，采用梯度洗脱。研究对比了HSS T3-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 µm）、BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 µm）、Tita-C18（2.1 mm×50 mm，1.9 µm）、Eclipse-Plus RRHD-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）、Hypersil Gold-C18（2.1 mm×50 mm，1.9 µm）作为目标物的预选分离柱。结果表明，血根碱和白屈菜红碱在上述C18色谱柱上的洗脱效果差别不大，均能满足检测要求。选择BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 µm）色谱柱进行下一步试验分析，色谱图见图1。

图1 饲料样品中血根碱和白屈菜红碱的液相色谱-串联质谱色谱图

2.3 提取溶剂的选择

血根碱和白屈菜红碱易溶于甲醇、乙醇、乙腈等极性溶剂中，故在样品提取过程中首先选用实验室常用的甲醇、乙醇、乙腈作为提取溶剂。

称取2 g 试样，加入40 mL 提取溶剂，涡旋，超声提取20 min，9 000 r/min 离心5 min。将上清液转移至50 mL 容量瓶中，用提取溶剂定容，混匀。吸取备用液约3 mL 过固相萃取柱及微孔滤膜，弃去约1 mL流出液，收集续滤液，待测。

研究以猪预混合饲料为代表基质，加标浓度为5 mg/kg，考察不同溶剂的提取效率，结果见图2。

图2 提取溶剂提取结果

由图2 可知，对于血根碱，乙腈和甲醇的提取效果较好；对于白屈菜红碱，只有乙腈的提取效果较好。但使用乙腈提取血根碱和白屈菜红碱时回收率也只有75%左右。

查阅相关文献可知，酸性溶液有助于血根碱和白屈菜红碱的提取[15]，因此为了提高回收率，考察在乙腈中加入甲酸、乙酸和盐酸以提高提取效率，结果见图3。

图3 酸性提取溶剂提取结果

由图3 可知，乙腈中加入盐酸后提取效率有改进。因此继续考察不同盐酸浓度（0、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、1.0%）对提取效率的影响，结果见图4。

图4 不同浓度盐酸乙腈溶液对提取效率的影响

由图4 可知，0.2%的盐酸乙腈溶液提取效果最佳，单次提取回收率在90%以上。

急性扁桃体炎诊断标准参照《中医病证诊断疗效标准·乳蛾的诊断依据》[1]：①以咽痛、吞咽困难为主要症状，可伴有发热。②起病急，病程短。③扁桃体充血肿胀、表面有脓点。④白细胞总数及中性粒细胞增高。

2.4 超声时间考察

一般情况下，超声有助于提高提取效率，延长超声时间有助于提高目标化合物的回收率，因此考察了不同超声时间对回收率的影响，结果见图5。超声10 min基本能将血根碱和白屈菜红碱提取完全，为了保证提取效率，将超声时间设为20 min，此时的回收率达到95%以上。

图5 不同超声时间对提取效率的影响

2.5 提取次数考察

为了进一步提高提取效率，对提取次数进行考察，加标浓度为5 mg/kg。

取2 g样品置于50 mL离心管中，分别进行1、2、3次提取（每次15 mL），超声时间为20 min，以9 000 r/min离心取上清，最终用0.2%盐酸乙腈溶液定容至50 mL。通过计算回收率，比较不同提取次数时的差异，结果见图6。由图6 看出，提取1 次的回收率达到90%以上，提取2 次的回收率达到95%以上，能提取完全。综合考虑工作效率等问题，确定提取次数为2次。

图6 不同提取次数对提取效率的影响

2.6 净化方法考察

为了保护色谱柱和质谱系统，需对提取液进行净化处理。

2.6.1 QuEChERS净化

QuEChERS 净化技术具有快速、简便、廉价、有效、稳定和安全等特点[16]。试验用了3 种配方的QuEChERS 净化包，分别为净化包1、净化包2、净化包3。

吸取1 mL 提取液加入到净化包中，涡旋30 s 后9 000 r/min离心2 min，取上清液过0.22 µm有机滤膜后进样分析，结果见图7。可见GCB（净化包3）对血根碱和白屈菜红碱具有非常强的吸附作用，导致提取液经净化包3 净化后回收率非常低。此外，含PSA 和C18的净化包也会对目标化合物有吸附，回收率不理想。

图7 QuEChERS净化效果

2.6.2 阳离子交换柱

选取Agilent SCX（200 mg，6 mL）强阳离子交换柱进行试验。使用前先用5 mL 甲醇和5 mL 水进行活化，吸取1 mL提取液和9 mL水混合后上样，用5 mL水和5 mL 甲醇淋洗，负压抽干后用6 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱。进行分步收集，每试管收集1 mL 洗脱液。对上样后的流出液和淋洗液进行检测，未检出血根碱和白屈菜红碱，说明SCX 能很好地吸附目标化合物。但收集到的6 管洗脱液中都含有血根碱和白屈菜红碱，第5 管洗脱液中仍有8 ng/mL 左右的目标化合物。可见SCX 固相萃取柱对血根碱和白屈菜红碱的吸附能力较强，结果见图8。

图8 固相萃取柱净化后回收率

2.6.3 MCX混合型阳离子交换柱

选取Waters MCX（60 mg，3 mL）混合型阳离子交换柱继续进行试验。使用前先用3 mL 甲醇和3 mL水进行活化，吸取1 mL 提取液和9 mL 水混合后上样，用3 mL 水和3 mL 甲醇进行淋洗，负压抽干后用5 mL 5%氨水甲醇溶液进行洗脱。进行分步收集，每试管收集1 mL 洗脱液。对上样后的流出液和淋洗液进行检测，未检出血根碱和白屈菜红碱，说明MCX 也能很好地吸附目标化合物。但收集到的5 管洗脱液中也都含有血根碱和白屈菜红碱，在5 mL 洗脱液中仍有2 ng/mL 左右的目标化合物。说明MCX 固相萃取柱对血根碱和白屈菜红碱的吸附能力也较强，结果见图8。

为了增加洗脱强度，提高氨水浓度至10%和20%。由结果可知增大氨水浓度对洗脱效果基本无影响。说明可能是由于阳离子交换柱中的填料本体对血根碱和白屈菜红碱有较强的吸附，导致目标化合物洗脱不完全。

2.6.4 多用途亲水-亲脂平衡反相吸附固相萃取柱

HLB（Hydrophile Lipophilic Balance）固相萃取柱是一种多用途亲水-亲脂平衡反相吸附固相萃取柱，适用于酸、碱和中性化合物的净化，可去除95%的常见基质干扰物，例如蛋白质、盐类、磷脂等。

取6 mL提取溶液，通过Waters HLB（500 mg，6 mL）固相萃取柱，分步收集5 mL 通过液，并进行液相色谱-串联质谱检测。由检测结果可知，只要弃去前面1 mL，血根碱和白屈菜红碱就有较好的回收率，回收率在95%以上，结果见图8。

2.7 基质效应

基质效应（ME）主要是由质谱检测器的离子化过程产生，在电喷雾时，基质内的组分与目标化合物共同流出喷雾针，对电荷产生竞争，将产生的雾滴牢牢吸在一起，改变了带电雾滴的表面张力，影响目标物的雾化、挥发、分裂、化学反应以及带电过程，致使进入质谱的离子减少或增加，从而影响定量分析的可靠性和准确性。

基质效应可通过公式ME（%）=基质溶液中标准曲线斜率/纯溶剂中标准曲线斜率×100 来评价[17]。ME 为85%～115%时，一般认为不存在基质效应；当ME＜85%时，则认为基质对目标化合物的响应产生抑制作用；当ME＞115%时，则认为基质对目标化合物的响应存在增强作用。血根碱和白屈菜红碱基质效应考察结果ME 为92.6%～103.0%，可见基质对血根碱和白屈菜红碱都无基质效应。

2.8 线性关系和检出限

对血根碱、白屈菜红碱标准工作溶液浓度为1～100 ng/mL 时进行仪器测定，以化合物浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性相关系数（r）≥0.999。

使用3 倍信噪比作为方法的检出限，10 倍信噪比作为方法的定量限。因此方法检出限为0.002 mg/kg，定量限为0.005 mg/kg。

2.9 回收率和精密度

在5 种基质中（添加剂预混合饲料、浓缩饲料、配合饲料、精料补充料和水产饲料）进行加标回收试验。加标浓度的低点为方法定量限（0.005 mg/kg），第二点在农业农村部公告第246号规定的最低点附近（0.1 mg/kg），第三点在农业农村部公告第246 号中规定的中间浓度附近（5 mg/kg），最高点在农业农村部公告第246号中规定的最高浓度附近（10 mg/kg）。每种基质每个加标水平进行6 次重复，总体回收率为91.9%～101.0%，相对标准偏差为2.00%～7.96%，结果见表2。

表2 方法的回收率、精密度（n=6，%）

2.10 试样测定

在市面上购买畜添加剂预混合饲料、畜浓缩饲料、畜配合饲料各2 批次，作为试验实际样品，用建立好的方法对其进行检测，测定结果见表3。由表3 可以看出，饲料中血根碱、白屈菜红碱的浓度范围为0.2～10.0 mg/kg。

表3 实际样品检测结果（mg/kg）

3 结论

本研究建立了一种使用液相色谱-串联质谱法测定饲料中血根碱和白屈菜红碱的方法。该方法具有良好的线性范围，在质量浓度为1～100 ng/mL 范围内其线性相关系数≥0.999；定量限为0.005 mg/kg；方法在添加剂预混合饲料、浓缩饲料、配合饲料、精料补充料和水产饲料基质中的四个浓度水平具有非常好的加标回收率和精密度，回收率为91.9%～101.0%，相对标准偏差为2.00%～7.96%。使用该方法对实际样品进行检测，证明该方法适用于饲料中血根碱和白屈菜红碱的测定。