■ 王虹娟 周晨雨 冯 茜 冯振宇 李 娜*

（1.太原师范学院生物科学与技术学院，山西晋中 030619；2.山西省中西医结合医院中心实验室，山西太原 030013）

核桃青皮，是胡桃与胡桃楸这两类胡桃科植物的外果皮[1]，产地集中于河北、山西与山东等[2]。主要功能为抗肿瘤、清热、止痢、解毒等；对于疣、疥癣等皮肤病具有外用价值[3]。核桃青皮不同于传统的药用青龙衣（为入伏采收的核桃未成熟果实的外果皮，带未成熟果核，切片晒制），为成熟核桃外表生长的一层厚厚的青皮。随着时间的推移，核桃最外层包裹的青皮会自然裂开，露出核桃，自然掉落在地上，供人们生食、炒食或榨油等，而核桃青皮最终作为农业废弃物丢弃。近年来，已有文献报道成熟的核桃外果皮中含有多糖等大分子化合物[4]。

多糖类化合物在动物胞膜及微生物、植物的胞壁内有着大量分布，具有重要的生物学功能，如抗病毒抗癌、免疫调节、降血糖等[5-6]。目前多糖的提取方法主要是水提法[7]，传统提取技术存在以下不足：提取率低、溶剂消耗量高、周期长、纯度不高等[8-10]。双水相萃取（aqueous two-phase extraction， ATPE）方法的所有操作都能够于室温中开展，所以对多糖生物功能活性的保持有利，并且具有生物相容性好、萃取率高、易于放大、目标产物活性损失少等特点[11-13]，已普遍用来提取黄酮、多糖、色素等活性物质[14-16]，但目前还没有研究涉及此项技术用于核桃青皮多糖（walnut peel polysaccharides， WPPs）的提取。因此试验经由Box-Behnken 响应面耦合遗传算法（genetic algorithm，GA）完成WPPs最优提取工艺条件的筛选，同时对此类多糖的体外抗氧化功能加以分析，旨在指导核桃青皮资源的有效利用。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

核桃青皮，白露节气之后采收的成熟核桃的外果皮。

K2HPO4、无水乙醇、苯酚、ABTS、葡萄糖(Glu)标准品，均为市购。

1.2 主要仪器与设备

电子天平（型号为JD200-4），沈阳龙腾公司制造；多功能粉碎机（型号为4500A）、智能恒温培养振荡器（型号为HNY-100B），天津市欧诺仪器公司制造；高速冷冻离心机（型号为HC-3018R），购自中科中佳科学仪器公司；分光光度计（型号为V-1100），购自美析仪器公司；光谱仪（型号为Nicolet iS5），赛默飞世尔科技公司制造。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备把自然晒干的核桃青皮置于多功能粉碎机内，先行粉碎处理，过筛，放入提前备好的密封袋，室温储存，备用。

1.3.2 双水相相图的绘制

采用浊点滴定法绘制双水相相图[17-18]。

1.3.3 葡萄糖标准曲线绘制

将葡萄糖标准品7.5 mg，倒入容量瓶中，放纯化水，定容至50 mL，再摇匀。分别吸取上述葡萄糖标准溶液40、80、120、160、200 µL，各以纯化水补至200 µL，然后依次加入5%苯酚400 µL，浓硫酸2 000 µL，把以上所有液体完全混匀，进行0.5 h 反应，测定OD490值，获得如下回归方程：Y=4.232 4X+0.005 2，R2=0.997 8。

1.3.4 核桃青皮多糖的提取

基于相图进行双水相体系的配制，体系呈30 g的总质量，而后加入提前备好的一定质量的核桃青皮粉末。放入恒温培养振荡器中萃取后，离心，收集下相，记录下相体积，最终得出核桃青皮多糖提取率。

式中：m——核桃青皮粉末加入体系内的重量（g）；

Cb——下相WPPs浓度为（mg/mL）；

Vb——下相体积为（mL）。

1.3.5 单因素试验

以多糖提取率作为考察指标，分别考察提取时间（10、20、30、40、50 min）、K2HPO4质量分数（12%、14%、16%、18%、20%）、加料量（0.50、0.60、0.75、1.00、1.50 g）、提取温度（20、30、40、50、60 ℃）、乙醇质量分数（28%、30%、32%、34%、36%）这几种因素对核桃青皮多糖提取率的影响。

1.3.6 Ethanol/K2HPO4体系提取核桃青皮多糖的Box-Behnken试验

把配制双水相所需K2HPO4质量分数、提取时间与提取温度这3 项因素当做变量，依次记作A、B、C，将WPPs提取率视为响应值，记作Y，设计试验，其中不变条件为制备双水相时需要的乙醇质量分数32%，体系中始终加料量为0.6 g。3个试验变量及试验水平见表1。

表1 响应面试验因素与试验数据

1.3.7 遗传算法设计优化提取工艺

本次试验采用了RSM 模型作为GA 的适应度函数。如公式（2）所示。

式中：f(X)——RSM模型得到的目标函数；

X——输入向量；

Y——核桃青皮多糖得率（mg/g）；

遗传算法优化的约束条件:选择各因素水平的上下限,下式为WPPs得率最佳的约束条件。

1.3.8 核桃青皮多糖的红外光谱(FT-IR)结构分析

将干燥的核桃青皮多糖样本4.0 mg 与干燥的溴化钾（KBr）在玛瑙研钵中研磨均匀后压片，使用Thermo Fisher Nicolet iS5 傅里叶红外光谱仪在400～4 000 cm-1范围内进行扫描分析。

1.3.9 检测核桃青皮多糖清除自由基能力

以1∶1 比例标准把7 mmol/L ABTS（试剂1）、2.5 mmol/L K2S2O8（试剂2）在常温环境中混匀，经过0.5 d 暗反应，获得ABTS 工作液。在刻度试管内加入多糖样品溶液，随后加入ABTS 溶液，混匀，但需在避光环境中操作，反应 10 min，检测OD734值。按式（3）计算自由基清除率及IC50值[19]。

式中：A0——ABTS（2.7 mL）工作液+纯化水（0.3 mL）的OD值；

Ar——无水乙醇（2.7 mL）溶液+样品溶液（0.3 mL）的OD值；

As——ABTS（2.7 mL）工作液+样品溶液（0.3 mL）的OD值。

1.4 数据处理

试验数据处理及作图分别运用了Design-Expert 13和GraphPad Prism 8.0软件；并且采用Matlab 2022b优化核桃青皮多糖提取工艺参数。试验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 双水相相图的绘制

如图1 所示，相图是一条曲线（MON）。根据相图，在两相区内选择乙醇和K2HPO4质量分数进行核桃青皮多糖提取试验。

图1 Ethanol/K2HPO4双水相相图

2.2 核桃青皮多糖提取的单因素试验

2.2.1 K2HPO4质量分数对核桃青皮多糖提取效果的影响

本试验由低到高分别选取了5种不同质量分数的K2HPO4，由于双水相体系中下相所占的体积越大越有利于多糖的提取，但下相的体积与K2HPO4的质量分数密不可分。由图2可见，在K2HPO4质量分数在16%时，可获得最高WPPs提取率，之后继续上调K2HPO4质量分数，多糖提取率反而呈现出下降的趋势。这可能是由于盐浓度越高，下相中溶解多糖的自由水的体积越少[20]，因此多糖的分配行为也受到影响，最终使得WPPs提取率下降。因此，选取16%作为核桃青皮多糖双水相提取的最适 K2HPO4质量分数。

图2 K2HPO4质量分数对多糖提取率的影响

2.2.2 核桃青皮多糖提取效果受乙醇质量分数的影响

如图3 所示，32%乙醇质量分数对应的多糖提取率位于折线图的最高点，随着乙醇质量分数继续上调，WPPs提取率会降低。原因可能在于乙醇质量分数上调后，进一步增强了其水化功能，增大了相比，减小了下相体积，就此弱化了K2HPO4溶解性，多糖提取受到负面影响。所以，最佳提取条件为乙醇质量分数32%。

图3 乙醇质量分数对多糖提取率的影响

2.2.3 加料量对核桃青皮多糖提取率的影响

从图4可以看出，加料量为0.6 g时呈现出最大的WPPs 提取率，之后继续上调加料量，WPPs 提取率开始下降。分析原因为溶质和溶液的接触面积随着加料量的增加而扩大，有利于多糖的溶出[21]；但在加料量超过0.6 g 后，上调加料量的同时，细胞内外的WPPs向溶解平衡状态发展，多糖不能完全溶出，传质速率和效率降低；同时随着加料量的不断增多，造成水溶性杂质同样增多[22]。说明样品用量过大或者过小都不利于WPPs 的提取。考虑到提取成本，选择0.6 g加料量作为多糖提取的最适提取参数。

图4 加料量对多糖提取率的影响

2.2.4 提取温度对核桃青皮多糖提取率的影响

由图5 可以看出，多糖提取率会因温度升高而增加，因温度下降而降低，植物多糖通常难溶于冷水、易溶于热水[23]。温度为30 ℃时，WPPs的提取率最大，为103.46 mg/g，可见，30 ℃为最理想的WPPs提取温度。

图5 提取温度对多糖提取率的影响

2.2.5 提取时间对核桃青皮多糖提取效果的影响

由图6可以看出，本次试验设置了5个时间点，在双水相体系为40 min 的萃取时间时WPPs 提取率最高；但萃取时间增加至50 min，多糖提取率变化不明显，并且时间延长会引起提取率降低。综合考虑，本研究中最理想的WPPs双水相提取时间为40 min。

图6 提取时间对多糖提取率的影响

通过以上单因素试验分析并综合考虑多糖提取率及试验成本等因素，可明确，提取WPPs的最佳单因素条件：组成双水相体系的乙醇质量分数为32%，K2HPO4质量分数为16%，加料量为0.6 g，提取最适时间是40 min，温度为30 ℃。除乙醇质量分数、加料量外，前述五个单因素中余下的三个因素对WPPs 提取率的影响程度皆在10%以上，因此，将加料量0.6 g 以及构成双水相体系的乙醇（32%）保持恒定，响应面测试方案优化指标即为K2HPO4质量分数、提取时间、提取温度。

2.3 响应面优化分析

2.3.1 Box-Behnken优化核桃青皮多糖提取率

选择的优化因素为K2HPO4质量分数（A）、提取温度（B）和提取时间（C），响应值（Y）为多糖得率，结果见表2，该结果拟合的二次回归方程为：

表2 Box-Behnken试验方案和测试结果

由表3 的方差分析结果可知，拟合模型极显著（P＜0.000 1），即每个因素及其响应值关系密切。P=0.175 1 为其失拟项，即试验数据与此模型在试验范围内的拟合性较高；信噪比大于4（17.449 5），证实产生了极高的信号强度；R2（拟合系数）等于0.982 2，表明试验数据与预测值吻合度较高；值为0.959 4，证实：测试考察变量造成的变化占比95.94%；4.25%的变异系数值证实在试验范围内模型稳定性一致。差异极显著（P＜0.01）的为一次项A和B、二次项A2和C2，差异显著（P＜0.05）的为交互项AB、BC、二次项B2。这表明K2HPO4质量分数和提取时间这两个因素对核桃青皮多糖得率具有显著影响。综合分析，本试验方法可靠，各因素水平间设计合理。

表3 响应面方差分析

2.3.2 模型准确性分析

核桃青皮多糖响应值的残差正态分布概率图如图7（A）所示，一条直线双侧相对合理地分布着17 组响应值，方差高度吻合。图7（B）显示，实测值极度趋同于预判值，证实3 个变量指标及其响应联系可以利用本次设计的模型有效拟合。图7（C）所示为基于建模拟合分析17 组试验运行数据与内部学生化残差的结果，表明各数据点全部没有超出极值，并且数据都落在[-3,3]。图7（D）说明杠杆值处在样本空间中心，全部＜1，证实试验模型不存在任何有效偏差。图7（E）则为基于DFBETAS值的差异图，17组运行数据均不会过多地影响到其回归系数；明显影响统计量的试验指标可以基于Cook’D 证实，第3 组和第13 组试验值为离群点，拟合二次多项式模型环节，需做剔除处理，但是结合图7（A）～图7（E）综合分析得到，第3 组和第13 组试验值为强影响点而非异常点，因此予以保留，其余15组试验值的Cook’D值在确定的范围内。本回归分析结果证实：核桃青皮多糖提取技术模型有相对较高的准确性。

图7 Box-Behnken模型准确度测试

2.3.3 交互作用分析

如图8（a）所示，响应面3D 图形呈现为一个向上拱起的曲面，可见双水相体系所含K2HPO4质量分数同提取时间的交互效应可显著影响WPPs 得率，并且具有极大值，此极大值见于响应曲面的最上方。从图8（b）中可以看出K2HPO4质量分数与提取时间的交互作用较强。同样，图9（a）也是一个向上拱起的曲面，颜色由深逐渐变浅，可见，在提取时间与温度上调时，WPPs 得率呈先提高后下降表现；图9（b）是图9（a）的等高线图，结果同图9（a）一致。

图8 提取时间与K2HPO4交互作用对多糖得率的影响

图9 提取时间与提取温度交互作用对多糖得率的影响

2.3.4 核桃青皮多糖最佳提取技术指标验证与优化

分析优化工具选择的是遗传算法优化工具箱（属Matlab2022b 软件），共需完成66 次迭代，此时K2HPO4质量分数（X1）、提取时间（X2）、提取温度（X3）试验水平分别为16.562 4%，33.646 5 min 和28.083 7 ℃，此条件下，WPPs得率最高预测值为114.519 mg/g。遗传算法结果如图10所示。

图10 遗传算法优化结果

2.3.5 验证试验

通过遗传算法可以得出优化工艺条件为：K2HPO4质量分数16.562 4%，提取时间33.646 5 min，提取温度28.083 7 ℃，所得核桃青皮多糖得率理论值为114.519 mg/g。为验证遗传算法，方便实际操作，将上述提取条件修改为：构成双水相体系的K2HPO4质量分数16%，提取时间34 min，提取温度为28 ℃时开展验证试验，重复3 次，最终得到WPPs 的得率为111 mg/g，试验值同理论值的相对误差是2.6%，说明响应面耦合遗传算法可较好地模拟和预测核桃青皮多糖得率，进一步证实采用遗传算法优化双水相提取核桃青皮多糖工艺参数是可行的，可为实际操作提供良好的指导。

2.4 核桃青皮多糖的抗氧化活性测定

由图11 可知，在试验浓度区间内，核桃青皮多糖和阳性对照BHT 对ABTS 自由基清除能力均呈对数增加趋势，核桃青皮多糖清除ABTS 自由基的IC50=0.12 mg/mL，阳性对照BHT 清除ABTS 自由基的IC50=1.36 µg/mL，清除率峰值（WPPs 浓度为0.5 mg/mL）为93.4%和95.57%（BHT 浓度为6 µg/mL）。因此可以推断出，采用双水相提取的核桃青皮多糖保留了其抗氧化活性。

图11 核桃青皮多糖对ABTS自由基的清除率

2.5 核桃青皮多糖的红外光谱结构分析结果

如图12所示，3 376.65 cm-1区域见宽且强的吸收峰，为WPPs分子间或者分子内O—H伸缩振动所致的强吸收，提示多糖中含有—OH基团。在1 657.08 cm-1处的吸收峰为羰基的C＝O 伸缩振动或形成了结晶水。1 085.65 cm-1的吸收峰为C—O—C 或C—O—H的变角振动，986.31 cm-1处为烯烃C—H 面外弯曲振动，位于862.73 cm-1的吸收峰说明多糖含β-糖苷键[24]。综合以上分析，说明采用双水相提取的核桃青皮多糖具有多糖化合物的显著特征。

3 讨论与结论

本研究以白露节气之后采收的成熟核桃的外果皮为原料，摒弃传统的水提法，采用新型双水相提取技术，由普通有机溶剂和无机盐溶液组成，该双水相系统具有极性高、成本低、反应条件温和、绿色环保等优点，并且保留了多糖的生物活性[25-26]。其中，乙醇价格低廉、无毒、易回收，具有较大的水化能，能与其形成双水相的盐较少，因此适合作为双水相体系的上相；K2HPO4在与乙醇形成的双水相中具有相对较宽的分相范围[27]，由新型双水相体系的分离机制推测，为无机盐溶解时结合水分子所产生的盐析效应引起，而高价盐的盐析作用要比低价盐的盐析作用大，因此磷酸盐体系分相效果好[28]，并且K2HPO4可以阻止一些杂蛋白的溶解[29]。由于K2HPO4呈微碱性且微溶于醇，能够稳定分相，因此将K2HPO4当作盐相[11]，最终确定乙醇/K2HPO4双水相为萃取核桃青皮多糖的最佳体系，将提取与分离两个过程合为一体[30]。试验采用乙醇/K2HPO4双水相体系提取并优化WPPs 的最佳工艺条件，结果显示，当K2HPO4质量分数、提取温度与时间分别为16%、28 ℃和34 min 时，WPPs 得率为111 mg/g，该提取工艺条件合理可行，可为多糖提取工业化提供良好的指导。本研究中双水相提取所得WPPs在3 376.65、1 657.08、1 085.65、986.31、862.73 cm-1均存在强且宽的吸收峰，符合多糖的结构特征。说明该方法所得WPPs 具有典型的多糖化合物的结构特征。体外抗氧化试验证实，经由双水相途径制备所得WPPs可以清除ABTS自由基，可见，WPPs具备成为一类天然抗氧化剂的潜力，可以应用于食品、保健品等领域，具有较高的研究开发价值。