■ 韩 勇

（山西药科职业学院，山西太原 030031）

在畜禽养殖中，植物提取物因具有免疫调节、促进生长、防病保健等多种功能，已成为绿色、安全、高效的新型饲料添加剂[1-2]。连翘[Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]是木犀科植物，在中草药中常以果实入药。连翘叶为药食同源和山西地方特色产品，在民间，连翘叶作为茶饮已有百年多历史[3]。李学敏等[4]研究连翘叶提取物的安全性，其提取物未发现有致突变和致畸作用。原江锋等[5]测定连翘叶提取物的抑菌活性，结果表明连翘叶提取物对供试细菌有较强的抑菌作用。王婷婷等[6]通过构建小鼠耳肿胀和大鼠棉球肉芽肿模型，发现连翘叶可以缓解炎症，对慢性炎症有较好的作用。连翘叶提取物还具有抗热应激、降血脂、抗氧化[7-9]等作用，已在功能性食品、食品添加剂、饲料添加剂等方面展现出良好的开发应用前景[10-12]。但在连翘叶的采收过程中，目前仅少量开发为连翘茶供饮用，绝大部分连翘叶没有得到充分利用，造成连翘资源浪费[13]。

本试验通过脂多糖（LPS）诱导小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）构建炎症反应细胞模型，研究比较了连翘叶不同提取物的抗炎活性，并采用纸片扩散法和微量肉汤倍比稀释法，对连翘叶不同提取物的抑菌活性、最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）进行比较研究，旨在筛选生物活性高的连翘叶提取物，为连翘叶作为新型饲料添加剂的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

连翘叶采自山西药科职业学院中药标本园。

大肠埃希菌[Escherichia coliCMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureusCMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilisCMCC(B)63501]，由山西药科职业学院生物制药试验室提供；巨噬细胞RAW264.7，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

DMEM 培养基、胎牛血清，购自美国Gibco 公司；胰蛋白酶消化液，购自北京索莱宝科技有限公司；白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒，购自武汉基因美生物科技有限公司；LPS、青霉素-链霉素溶液、一氧化氮（NO）检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；胰酪大豆胨琼脂培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司；肉汤培养基、肉汤琼脂培养基，购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

CW-160 型CO2细胞培养箱，购自上海远怀实业有限公司；XDS-1A型倒置生物显微镜，购自上海精密仪器仪表有限公司；3000FA 型多功能酶标仪，购自上海闪谱生物科技有限公司；XFH-50CA 型压力蒸汽灭菌器，购自浙江新丰医疗器械有限公司；SW-CJ-1F型超净工作台，购自上海领仪科技有限公司；SPX180 型生化培养箱，购自江苏天翎仪器有限公司；FA2004N型电子分析天平，购自上海菁海仪器有限公司。

1.2 提取物制备

取连翘叶粉末500 g，放入提取容器中，按液料比8∶1，分别加入不同的提取溶液，提取溶液为实际生产中常用的溶液，分别为水、体积分数40%乙醇和80%乙醇。经回流提取，将提取液减压干燥，得固体粉末，即水提取物、40%乙醇提取物和80%乙醇提取物。所得固体粉末加入无菌水制成不同质量浓度的连翘叶提取物溶液，抗炎活性试验中的连翘叶提取物组为含不同质量浓度（分别为2.5、5、10、20、40、80 µg/mL）的连翘叶水提取物、40%乙醇提取物和80%乙醇提取物；抑菌活性测定中的连翘叶提取物组为含不同质量浓度（分别为50、100、200、400 mg/mL）的连翘叶水提取物、40%乙醇提取物和80%乙醇提取物。

1.3 抗炎活性试验

1.3.1 细胞培养

巨噬细胞RAW264.7 培养于含1%青霉素-链霉素溶液和10%胎牛血清的DMEM 培养基，置于CO2培养箱5% CO2、37 ℃培养。

1.3.2 检测NO水平

按照“1.3.1”操作方法培养巨噬细胞，待细胞生长到对数期，制备细胞密度为1×105个/mL 的单细胞悬液，将单细胞悬液接种于96 孔板，每孔接种100 µL，置于CO2培养箱5% CO2、37 ℃培养24 h。设空白对照组、LPS组、LPS+提取物组，每组3个平行孔。空白对照组加入100 µL 细胞培养液，LPS 组加入含1 µg/mL LPS 的100 µL 细胞培养液，LPS+提取物组加入含1 μg/mL LPS 和提取物（质量浓度2.5、5、10、20、40、80 µg/mL）的100 μL 细胞培养液。置于CO2培养箱5% CO2、37 ℃培养48 h，用NO检测试剂盒（Griess法）检测细胞的NO水平。

1.3.3 检测炎症因子

按照“1.3.2” 操作方法培养巨噬细胞和制备单细胞悬液，并进行分组，试验组分别加样后置于CO2培养箱5% CO2、37 ℃培养24 h，用酶联免疫分析试剂盒（ELISA 法）检测细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α生成水平。

1.4 抑菌活性试验

1.4.1 菌悬液制备

在超净工作台中，将供试菌种接种于胰酪大豆胨琼脂培养基，置生化培养箱35 ℃培养24 h，活化传代2 次，备用。无菌操作取已活化后的供试菌于灭菌水中，调整菌体浓度为1×106CFU/mL 的菌悬液，于低温保存，备用。

1.4.2 抑菌活性测定

采用纸片扩散法，通过十字交叉法测量抑菌圈直径，测定抑菌活性。取直径6 mm 的药敏纸片，经灭菌后，分别浸于连翘叶提取物溶液（质量浓度50、100、200、400 mg/mL）和无菌水中，待纸片充分吸收溶液后备用。

熔化经灭菌后的牛肉膏蛋白胨固体培养基，倒入已灭菌的培养皿中，制平板，待平板冷却凝固后，取供试菌的菌悬液0.5 mL用涂布棒均匀接种于平板，然后将药敏纸片放于平板表面，每组样品做3 个平行对照，无菌水纸片为空白对照。将平板置于生化培养箱35 ℃培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.4.3 最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）测定

采用微量肉汤倍比稀释法测定最低抑菌浓度[14]。取无菌96 孔板，将100 µL 肉汤培养基加入第2～11 列的每孔中。第1、2 列的孔中加入100 µL 连翘叶提取物溶液，将孔内溶液吹打均匀，从第2 列孔中取100 µL 溶液加入第3列孔并吹打均匀，以此类推进行倍比稀释至第10 列孔。将100 µL 菌悬液加入第1～11 列的每孔中，吹打均匀。第11 列孔为阴性对照。取200 µL 肉汤培养基加入第12 列的孔中，为空白对照。将96孔板置于生化培养箱35 ℃培养24 h后观察菌体生长情况，以孔内溶液澄清无混浊的浓度即为MIC。

取以上MIC 的孔内溶液100 µL，均匀涂布于肉汤琼脂培养基平板中，将平板置于生化培养箱35 ℃培养24 h，以不超过5个菌落数的平板所对应的96孔中的最低浓度为MBC[15]。每组样品做3 组平行对照，结果取平均值。

1.5 数据统计学分析

每个试验样品平行测定3 次。试验数据采用SPSS 21.0进行统计学分析，数据用（x±s）表示，组间统计学差异比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 抗炎活性试验

2.1.1 连翘叶提取物对NO生成水平的影响

巨噬细胞RAW264.7在LPS刺激下产生NO，已成为研究抗炎活性的体外模型[16]。由图1 可知，在对照组中，细胞生成的NO 水平较低，在LPS 组中正常细胞经LPS 诱导后，生成大量NO。与对照组相比，LPS 组中NO 生成水平极显著升高（P＜0.01），表明已成功构建细胞炎症反应模型。

图1 连翘叶提取物对NO生成水平的影响

与LPS 组相比，3 种连翘叶提取物的各质量浓度组对NO 的生成量均有抑制作用，随着连翘叶提取物质量浓度增加，抑制NO 生成的作用也不断增强。与LPS 组相比，除水提取物2.5、5 µg/mL 组和40%乙醇提取物2.5 µg/mL组外，3种连翘叶提取物的其余各质量浓度组均能极显著降低LPS 诱导细胞产生的NO 生成水平（P＜0.01）。其中，乙醇提取物抑制NO 生成作用较水提取物强，80%乙醇提取物抑制作用优于40%乙醇提取物。

2.1.2 连翘叶提取物对炎症因子生成水平的影响

巨噬细胞在静息状态只生成极微量的炎症物质。经LPS 刺激后，巨噬细胞能够生成大量炎症物质。这些高浓度的炎症物质是诱发机体产生炎症反应的重要因素，其中，IL-β、IL-6和TNF-α是巨噬细胞产生的主要炎症因子。由图2可知，与对照组相比，LPS组中的细胞经LPS 刺激后，IL-1β、IL-6、TNF-α 的生成水平极显著升高（P＜0.01），表明已成功构建细胞炎症反应模型。

图2 连翘叶提取物对IL-1β、IL-6和TNF-a生成水平的影响

与LPS 组相比，3 种连翘叶提取物的各质量浓度组对IL-1β、IL-6 和TNF-α的生成量均有抑制作用，并且随着提取物质量浓度的增加，抑制作用也随之增强。与LPS 组相比，除水提取物2.5、5 µg/mL组和40%乙醇提取物2.5 µg/mL 组外，3 种连翘叶提取物的其余各质量浓度组均能显著或极显著降低LPS 诱导细胞产生的IL-1β、IL-6 和TNF-α生成水平（P＜0.05 或P＜0.01）。其中，乙醇提取物抑制作用较水提取物强，80%乙醇提取物抑制作用优于40%乙醇提取物。

2.2 抑菌活性试验

2.2.1 连翘叶提取物抑菌活性测定

由表1 可知，与对照组相比，3 种连翘叶提取物的各质量浓度组对供试菌均有抑菌活性，且抑菌圈直径显著或极显著升高（P＜0.05或P＜0.01），随着连翘叶提取物质量浓度的增加，抑菌圈增大，抑菌活性更加显著。相同质量浓度下的3 种连翘叶提取物抑菌效果依次为40%乙醇提取物＞水提取物＞80%乙醇提取物。3 种连翘叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强，对枯草芽孢杆菌次之，对大肠埃希菌稍弱。40%乙醇提取物的400 mg/mL质量浓度组对3种供试菌的抑菌圈为15～20 mm，属于高度敏感抑制作用，40%乙醇提取物的200 mg/mL 质量浓度组对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为15～20 mm，属于高度敏感抑制作用；水提取物的400 mg/mL 质量浓度组对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌也属于高度敏感抑制作用；其余各类提取物的100、200 mg/mL质量浓度组对3种供试菌的抑菌圈为10～15 mm，属于中度敏感抑制作用。

表1 抑菌活性测定结果

2.2.2 连翘叶提取物MIC和MBC测定

由表2、表3、表4可知，水提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的MIC 分别为12.5、25、50 mg/mL，MBC 分别为25、50、200 mg/mL。40%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的MIC 分别为6.25、12.5、25 mg/mL，MBC 分别为6.25、25、50 mg/mL。80%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的MIC分别为12.5、25、50 mg/mL，MBC分别为25、100、200 mg/mL。MIC和MBC测定结果表明，40%乙醇提取物的抑菌和杀菌效果最好，与纸片扩散法抑菌活性测定的结果相符。

表2 对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC测定结果

表3 对枯草芽孢杆菌的MIC和MBC测定结果

表4 对大肠埃希菌的MIC和MBC测定结果

3 讨论

3.1 抗炎活性比较研究

在炎症反应的体外试验研究中，小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 是一种广泛应用的炎症反应细胞模型。在LPS 刺激下，巨噬细胞产生大量炎症物质，这些炎症物质相互影响与作用，在炎症反应中具有重要的调节作用，从而生成严重的炎症反应。这些炎症物质的生成水平已成为检验炎症反应的有效依据。

NO 作为细胞间信息传递的调节因子，参与炎症反应和细胞免疫。当炎症反应发生时，会增加机体合成与释放NO的水平，高水平的NO能诱导其他炎症物质的表达，导致炎症反应程度的加剧，并损伤DNA，使细胞产生毒性作用，抑制生成过量的NO，对降低炎症反应造成细胞的毒性损伤有实际意义。

IL-1β是机体在炎症初期产生的炎症因子，能够增强免疫细胞的杀伤作用。IL-6 是多功能的炎症因子，具有抗炎和致炎作用，正常生成水平的IL-6 能对机体产生有益作用，但生成水平过高的IL-6 能诱发机体的炎症反应。TNF-α因具有细胞间信息传递的功能，能够刺激机体炎症的产生与发展，是预防与治疗炎症反应的靶向物质之一。当机体发生炎症反应时，将增强TNF-α的合成与释放水平，高水平的TNFα 能刺激其他炎症物质的生成，促进炎症反应的加剧[17]。

本研究中，巨噬细胞经LPS 刺激后，产生的NO、IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度明显升高，提示炎症反应巨噬细胞模型已构建成功。杨本军等[18]研究表明，连翘苷能明显抑制LPS诱导的巨噬细胞NO、TNF-α、IL-6 的分泌。Wang 等[19]研究表明，连翘酯苷A 能显著抑制LPS 诱导的NO、TNF-α、IL-1β等细胞炎症介质的生成。全云云等[20]研究表明，连翘脂素、连翘酯苷A和连翘酯苷B 的抗炎活性较强。本抗炎活性试验结果与上述研究结论基本相符，3 种连翘叶提取物对NO、IL-1β、IL-6 和TNF-α的生成量均有明显抑制作用。

这些具有抗炎活性的物质在连翘叶中均有较高含量，其中的连翘苷、连翘脂素和连翘酯苷A 含量均高于连翘果[21-23]。王娅丽等[24]研究发现，连翘叶中连翘苷类成分提取的主要影响因素是乙醇体积分数，85%乙醇对连翘苷类成分的提取效果最好。王杰等[25]应用响应面法优化连翘叶中连翘苷的提取工艺，最佳提取条件中的乙醇体积分数为80%。在本研究中，3 种连翘叶提取物的抗炎活性效果依次为80%乙醇提取物＞40%乙醇提取物＞水提取物，连翘叶经80%乙醇提取，提取物中抗炎有效成分的含量高，因而抗炎活性较强。

3.2 抑菌活性比较研究

王小敏等[26]研究发现，连翘叶乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌均有抑菌活性。已有研究报道，连翘酯苷A 是连翘的主要抑菌物质之一[27]，而且乙醇对连翘酯苷A 的提取效果较好。刘路路等[28]研究发现，乙醇体积分数为40%时连翘酯苷A 提取量达峰值。本研究中，综合抑菌活性测定和MIC 和MBC 测定结果，3 种连翘叶提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌均表现出良好的抑菌活性，且对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强。抑菌活性效果依次为40%乙醇提取物＞水提取物＞80%乙醇提取物，其中40%乙醇提取物的抑菌作用表现最好，可能在40%乙醇提取物中连翘酯苷A 等抑菌物质的含量较高，因而抑菌效果较好。这与其他研究者的结论基本一致。因而具有良好抑菌活性的连翘叶乙醇提取物有望成为饲料添加剂中的抑菌剂。

4 结论

3 种连翘叶提取物的抗炎活性为80%乙醇提取物＞40%乙醇提取物＞水提取物；抑菌活性为40%乙醇提取物＞水提取物＞80%乙醇提取物。连翘叶为药食同源产品，目前主要研究方向在药物与食品领域。本研究将为连翘叶作为新型饲料添加剂的深入开发利用拓展新途径。