■ 李一藩 邬泳江 薛文洁 胡建华，2，3* 宋智青 刘占英，2，3

(1.内蒙古工业大学化工学院，内蒙古呼和浩特 010050；2.内蒙古自治区发酵产业节能减排工程技术研究中心，内蒙古呼和浩特 010050；3.生物发酵绿色制造内蒙古自治区工程研究中心，内蒙古呼和浩特 010050；4.内蒙古工业大学理学院，内蒙古呼和浩特 010050）

木聚糖是一种多聚木糖，是植物细胞壁中半纤维多糖的主要成分[1]，在自然界中的含量十分丰富。木聚糖酶是一类组成十分复杂的Q 酶系列，主要作用是将木聚糖分解为木二糖、木三糖及少量的木糖等。木聚糖酶广泛存在于各种微生物中，研究较多的有芽孢杆菌[2]、木霉[3]、曲霉[4]及毕赤酵母[5]等。木聚糖酶广泛应用于能源[6]、食品[7]、饲料[8]、生物催化[9]、造纸[10]、纺织[11]等行业，具有较大的市场及研究价值。酸性木聚糖酶的最适反应pH 为酸性。动物饲料中通常含有一些难以被动物消化吸收的非淀粉多糖，其主要成分是木聚糖，许多缺乏分解该类物质的酶的动物长期食用这种饲料，将严重影响其对食物的吸收利用，进而影响生长状况。在动物饲料中添木聚糖酶，除可以降解饲料中的木聚糖以提高饲料利用率外，还可以提升肉鸡的生长性能[12]。Alokika等[13]研究表明，在家禽饲料中添加木聚糖酶提升了饲料的营养价值；Liu 等[14]研究了木聚糖酶对肉鸡生长性能、养分消化率的影响，发现在饲料中添加木聚糖酶改善了肉鸡生产性能及内源酶活性。此外，在果汁的澄清、酿酒和制备低聚木糖时[15-16]酸性木聚糖酶也有重要的应用。

自20世纪60年代Murr[17]研究发现高压电场可以影响鸡足草的生长后，人们开始关注高压电场对生物的影响。近年来，研究者开始研究电场对微生物的诱变效应。鲍秀珍等[18]探讨了直流高压静电场对黑曲霉存活率、酶活性、诱变率、菌落形态和菌体生长速度的影响。宋智青等[19]采用高压电晕电场诱变大肠杆菌，发现高压电晕电场是一种低损伤而诱变效率高的诱变剂。本研究筛选出一株产酸性木聚糖酶的菌株，通过高压电场诱变选育高酶活性的突变菌，在验证高压电场提高木聚糖酶活性的同时，提供了新的产酶菌株。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

土壤样品，采自内蒙古包头市农田；粗制木聚糖，玉米芯碱溶法提取；85%玉米芯木聚糖，购自上海源叶生物科技有限公司；D-(+)木糖，购自上海易恩化学技术有限公司；蛋白胨、琼脂粉等为生物试剂（BR）级；其他试剂均为分析纯（AR）级。

1.2 培养基

初筛培养基：硫酸铵0.2%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1%，氯化钠0.05%，自制木聚糖1.0%，琼脂粉2%。

复筛培养基：蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，氯化钠1%，自制木聚糖0.5%。

产酶培养基：硫酸铵0.5%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，酵母粉0.5%，自制木聚糖0.5%。

富集培养基：自制木聚糖1.0%，蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%。

1.3 方法

1.3.1 粗制木聚糖

玉米芯粉碎后沸水浸泡2 h，过滤后取滤渣与10% NaOH溶液按1∶10（W∶V）混合，80 ℃水浴2 h，盐酸中和滤液，用95%乙醇按1∶1 比例添加，静置过夜，滤渣干燥后即为粗制木聚糖。

1.3.2 木聚糖酶生产菌筛选

平板初筛：取1 g 土壤样品加入100 mL 无菌水恒温振荡0.5 h，吸取1 mL 清液加入富集培养基中，30 ℃、180 r/min 培养2 d。稀释成10-1、10-2、10-3的稀释液，取0.1 mL 于初筛培养基的平板上涂布，30 ℃培养2 d。用1 mg/mL 的刚果红溶液染色，2 h 后再用1 mol/L 的NaOH 溶液洗涤，观察并记录透明圈直径（H）与菌落直径（D）的比值（H/D），并挑取H/D 值较大的菌株于复筛培养基中分离纯化得到单菌落。

摇瓶复筛：挑取纯化的菌株于50 mL 种子培养基（250 mL 锥形瓶）中，30 ℃、180 r/min 培养12～14 h 获得种子液。适当稀释种子液，以空白培养基作为对照，使其OD600值调整为0.01。取1 mL 种子液接种于产酶培养基中，在相同的条件下培养3 d，8 000 r/min离心5 min后取上清液测定酶活性。

酶活性的测定：采用DNS 比色法，将培养液于8 000 r/min 离心5 min，取上清液即粗酶液0.2 mL，加入盛有1.0%木聚糖底物溶液0.8 mL的比色管中，60 ℃恒温反应5 min，加入DNS 试剂1 mL，沸水浴5 min，迅速冷却，补加纯化水至25 mL，以灭活的酶液作为对照组，在紫外分光光度计中测定OD540值，根据木糖标准曲线计算酶活性。

酶活性单位定义：在一定温度和pH 的条件下，每毫升粗酶液每分钟分解木聚糖产生1 µmol 木糖所需的酶量为一个酶活性单位。选取酶活性最高的菌株保存，进行下一步研究。

式中：N——稀释倍数；

C——由标准曲线查得的木糖浓度（mg/mL）；

M——木糖的相对分子质量；

T——反应时间（min）；

V——粗酶液体积（mL）。

1.3.3 酶学性质研究

最适pH 的测定：在60 ℃下分别于不同pH（3.0～10.0）条件下测定酶活性，测定最适反应pH（pH 3～5 为0.2 mol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液；pH 6～8 为0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓 冲 液；pH 9～10 为0.2 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液）。

最适温度的测定：在最适反应pH 下，分别于不同温度（30～70 ℃）条件下测定木聚糖酶活性，确定最适反应温度。

稳定性试验：将酶液在最适反应条件下保温4 h，每隔0.5 h取样测定酶活性，反应前的酶活性为100%。

1.3.4 菌株的鉴定

将出发菌株送往生工生物工程（上海）股份有限公司测定其16S rRNA，通用引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），测序结果在NCBI上进行比对分析。

1.3.5 高压电场诱变

将出发菌株接种于种子培养基上，30 ℃恒温振荡培养过夜，10 000 r/min 离心2 min，取沉淀，用0.85%的无菌生理盐水冲洗2 次并适当稀释菌悬液，利用细胞计数板调整其浓度为108个/mL。每个无菌平皿注入4 mL菌悬液，在冰浴状态下转移至诱变设备。

所用针-板高压电晕电场[19]，极间距3 cm，在电压0～24 kV下处理0～10 min。诱变处理后在冰浴中转移至超净工作台，各样品取0.1 mL涂布于筛选平板。以原始菌株作为对照，存活率记作100%，计算各组存活率（R）。

式中：R——存活率（%）；

A——对照组活菌数（CFU/mL）；

D——试验组活菌数（CFU/mL）。

以刚果红染色法选取透明圈与菌落直径比较大的菌落进行保存，并测定酶活性。最佳突变菌株传代培养7代，进行遗传稳定性试验，测定酶活性。

2 结果与分析

2.1 出发菌株的筛选及鉴定

在土壤样品中以木聚糖为唯一碳源经平板初筛与摇瓶复筛后，分离出一株于弱酸性环境下仍有较高酶活性的菌株，如图1 所示。菌落呈白色、边缘不规则的圆形，表面光滑黏稠。革兰氏染色为阳性。

图1 菌落形态

对菌落16S rRNA 进行测序后得到一条1 430 bp的序列，在NCBI上进行BLAST比对，该菌株与沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）的同源性最高，利用软件MEGA 7构建系统发育树。将其归于芽孢杆菌目芽孢杆菌科沙福芽孢杆菌属，命名为Bacillus safensisB16。

2.2 出发菌株产酶的酶学性质

2.2.1 最适反应条件

如图2（a）所示，该酶的最适pH 为5，是一种酸性木聚糖酶，在pH 4～7都具有较高的活性，在pH 4以下及碱性环境中，酶活性急剧下降。图2（b）为不同反应温度时酶活性的大小，该酶的最适温度为60 ℃，且在70 ℃仍有近90%的酶活性，说明其具有较好的高温耐受性。在最适反应条件下，木聚糖酶活性为217.34 U/mL。有研究表明，在酸性环境中木聚糖酶分解产物中木二糖、木三糖的含量增加[20]。此外，饲料、酿酒等工业生产领域需要酸性木聚糖酶的参与；较高的反应温度范围则意味着生产中耗能以及各类催化剂用量的降低，进而带来经济效益[21]，因而该酶具有一定的工业应用价值。

图2 最适反应条件

2.2.2 木聚糖酶的稳定性

图3显示了60 ℃、pH 5条件下木聚糖酶的稳定性。在该pH条件下，经过240 min的处理后酶活性能保持在44.4%，说明该酶在酸性条件下具有较好的稳定性，利用Origin软件进行拟合，得出该酶在60 ℃下的半衰期为229 min。在耐热性方面该酶具有一定的优势，但距性能卓越的木聚糖酶仍有一定差距。Collins等[22]的研究表明，饲料用酶需要在pH 4.8的环境中有较高的活性，因而该酶在饲料工业中有一定的应用潜力。如Han等[23]所研究的木聚糖酶在60 ℃下处理180 min后剩余酶活性超过90%。为进一步提升菌株B16所产木聚糖酶的工业应用价值，后续研究中可以参考Zhou等[24]的研究，利用分子环化技术进一步提升该酶的热稳定性。

图3 最适反应条件下的稳定性

2.3 高压电场诱变

2.3.1 存活率

如图4所示，在14 kV及以下电压处理的样本中，诱变10 min后出发菌株仍旧有40%以上的存活率，且在6 kV 和8 kV 两组中致死率近乎为零（数据略）。试验结果与宋智青等[19]的研究结果一致，高压芒刺电场的诱变效应具有低损伤的特点。诱变处理后的菌液按一定比例稀释，涂布于平板上，利用刚果红染色法初筛后随机选取了部分诱变组，进行突变菌株的筛选。

图4 突变菌株的存活率

2.3.2 突变菌株的选育

图5 为部分突变菌株在平板上的透明圈与菌落直径之比，以及摇瓶发酵的酶活性，两者并没有一致性，推测是由于菌株以及酶蛋白在平板和液体培养基中的性能不同。其中Bacillus safensisB16106-2 产酶的酶活性最高，为256.73 U/mL，选择此菌株作为高酶活性的诱变菌株，其最佳酶活性反应条件没有发生改变（数据略）。

图5 突变菌株的产酶能力

2.3.3 诱变菌株木聚糖酶的稳定性

突变菌株B16106-2 所产木聚糖酶的酶活性虽然有明显的提升，但整体趋势未变，如图6所示，在60 ℃、pH 5条件下稳定性有所下降，半衰期降低为214 min。推测由于高压电晕电场诱变带来的基因改变引起了木聚糖酶结构的改变，从而降低了该酶的热稳定性。

图6 最适反应条件下的稳定性

2.4 遗传稳定性

由图7可知，该突变菌株在7次传代过程中，产酶能力基本不变，酶活性为242.05～257.84 U/mL，具有良好的遗传稳定性。

图7 遗传稳定性试验

3 讨论

尽管人们对微生物来源木聚糖酶的研究已经十分深入，但有关菌株改良方面仍有待探讨。诱变选育是利用物理方法或化学诱变剂诱导菌株产生变异，再经过反复筛选得到并保持可遗传的有利突变，从而获得高性能菌株的一种手段。由于电场具刺激细胞增殖、诱导细胞融合等生物效应，高压电场被用于医疗[25]、发酵工业[26]以及微生物诱变育种[18]中。

本研究从包头市的土壤样品中筛选出一株酸性木聚糖酶产生菌株B.safensisB16，产生的木聚糖酶在pH 5～7、温度在50～70 ℃时均有较高的活性。Devi等[27]所研究的沙福芽孢杆菌生产的木聚糖酶虽然最适反应温度也为60 ℃，但最适反应pH 为9.0，且在pH 7.5～9.0 有较高的酶活性，是一种耐热的碱性木聚糖酶。后续对菌株B16 所产木聚糖酶进行稳定性研究，发现其在pH=5 的条件下有较好的稳定性，处理240 min 后仍保持40%左右的活性，相较于赵婷等[28]研究的木聚糖酶，在耐酸性上具有一定的优势。本研究筛选的木聚糖酶也具有优良的热稳定性，在60 ℃时的半衰期约为229 min，但距一些嗜热酶仍有一定差距，如Wang 等[29]的研究中，木聚糖酶在100 ℃下处理120 min 后剩余酶活性仍有80%以上，极强的热稳定性意味着其巨大的工业应用潜力。总体而言B.safensisB16具有较好的应用价值。

选择在电压6～24 kV、极间距3 cm 的高压芒刺电场中进行诱变，发现在6 kV 和8 kV 的电压下处理10 min后致死率仍旧为0，而在其他较低诱变剂量中的结果也与之相同，甚至有部分诱变组平板的活菌数明显高于对照组平板，表现出对菌株的刺激效应。可能是由于经电场处理后细胞受到刺激而加速分裂，进而生长出更多的菌落形成单位。宋智青等[19]的研究中，大肠杆菌在相对于较低的诱变剂量中有着较低的存活率，如在1 kV/cm下处理10 min存活率仅为7.2%，推测原因可能有两个：一是本研究诱变处理的是菌悬液，与烘干后的样品进行处理的方法有所差异；二是本研究的选择菌株为芽孢杆菌，是一种革兰氏阳性细菌，相较于大肠杆菌等革兰氏阴性细菌有着较为坚韧、强度更高的细胞壁，B.safensisB16可能因此对于电场的电穿孔效应、离子风的直接蚀刻等有着较高的耐受性。

对突变菌株B.safensisB16106-2所产木聚糖酶的酶学性质进行研究，发现虽然酶活性提升18.12%，但最适反应条件不变，而热稳定性有所下降，在60 ℃下的半衰期降为214 min，具体的机理有待深入研究。一些报道中，在改良木聚糖酶热稳定性的同时，降低了其催化效率，同样限制了产木聚糖酶菌株的改良以及应用方面的发展。后续研究可对突变菌株的序列以及所产木聚糖酶的结构进行分析，对比氨基酸组成、二硫键、氢键和疏水作用等影响蛋白质耐热性的因素，或许可以成为木聚糖酶热稳定性研究的突破点。或利用定点突变[30]、分子环化[24]等方法提高菌株B.safensisB16106-2所产木聚糖酶的热稳定性，以提升其工业应用价值。

4 结论

在土壤中筛选得到一株产酸性木聚糖酶的沙福芽孢杆菌B.safensisB16，该菌株生产的是耐热性良好的酸性木聚糖酶，最适反应条件为60 ℃、pH 5，且催化效率较高。经高压电晕电场诱变后酶活性达到256.73 U/mL，较出发菌株提升了18.12%，同时具有较好的遗传稳定性，证明高压电晕电场对于产木聚糖酶菌株的改良是一种有效的诱变方式。高压电晕电场诱变菌株B.safensisB16106-2 所产木聚糖酶的最适反应条件未变，但耐热性有所降低，其具体的机制仍有待研究。