王雅清,王 勇,刘永胜

(保定市第二医院内分泌科,河北 保定071051)

糖尿病视网膜病变(Diabetesretinopathy,DR)是一种可导致失明的糖尿病微血管并发症,近年来其发病率有升高趋势[1]。目前,激光、手术和玻璃体内注射抗血管内皮生长因子等是临床治疗DR的重要手段,但防治效果并不理想[2]。既往研究[3-5]显示,具有广泛药理活性的天然化合物在防治DR方面有着潜在的临床研究价值。芦丁是槐米的主要成分,是一种天然的黄酮苷,具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗病毒等功效,可减轻牙周膜干细胞的炎症效应[6],但其在治疗DR方面的作用并不清楚。本课题拟通过糖尿病大鼠模型,探讨芦丁在 DR中的作用及分子机制,为 DR的预防和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物:健康雄性SD大鼠50只(8周龄、体重180～220 g),购于河北大学实验动物中心,使用许可证号SYXK(冀)2022-009;大鼠在温度为25～27 ℃、湿度为55%～65%、昼夜交替12 h的环境下自由进食、饮食。本实验经本院动物实验伦理委员会批准。

1.1.2 药品与试剂:芦丁(纯度≥98%,CAS编号153-18-4),购于长沙禾普生物科技有限公司;伊凡斯兰购于美国Sigma公司;Trizol、高效放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液(组织/细胞)、动物组织/细胞总蛋白提取试剂盒,购于北京索莱宝科技有限公司;兔抗鼠B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(BAX)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体,英国Abcam公司;兔抗鼠剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)多克隆抗体,美国Cell Signal公司;原位末端标记(Tunel)细胞凋亡试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司;肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β 酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒,购于江苏酶免实业有限公司。

1.1.3 仪器:One Touch Ultra血糖测定仪,上海强生医疗器材有限公司生产;Synergy-HT 多功能酶标仪,美国 Bio-Tek 公司生产;Chemi Doc XRS图像分析系统,美国Bio-Rad公司生产;IX83荧光显微镜,日本Olympus公司生产;7500荧光定量 PCR 仪,美国 ABI 公司生产。

1.2 研究方法

1.2.1 造模、分组和给药:造模前大鼠禁食12 h,可自由饮水,参照文献[7]以腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素的方法制备糖尿病大鼠模型,注射后3 d尾静脉取血测量血糖浓度,当血糖浓度>16.7 mmol/L时表示模型制备成功。将造模成功的大鼠随机分为芦丁低、中、高剂量组及模型组,分别给予50、100、150 mg/(kg·d)芦丁及相同剂量的0.9%氯化钠溶液,正常大鼠20只为对照组,给予相同剂量的0.9%氯化钠溶液,持续12周。

1.2.2 血糖仪、伊凡斯兰实验分别测定大鼠血糖和视网膜组织中伊凡斯兰渗透量:给药干预结束后,随机选取10只大鼠,禁食12 h后尾静脉取血,使用血糖测定仪测定大鼠血糖浓度;尾静脉快速注入20 g/L伊凡斯兰,2 h后戊巴比妥钠腹腔麻醉摘取眼球并分离视网膜,参照文献[8]称重后,加入甲酰胺65 ℃孵育15 h,低温高速离心后,收集上清,分光光度计测定628 nm与740 nm处的吸光度值之差,根据标准曲线对伊凡斯兰进行量化,并以组织蛋白(μg/g)表示。

1.2.3 Tunel法检测大鼠视网膜组织神经节细胞凋亡:将各组剩余大鼠麻醉处死后,摘取眼球并分离视网膜,部分组织保存于4%多聚甲醛中备用;另一部分组织制成石蜡切片,根据参考文献[9]洗脱切片后,以含蛋白激酶 K双蒸水孵育15 min;Tunel反应液避光孵育1 h,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后、封片,使用荧光显微镜对凋亡细胞数进行观察并计算凋亡指数,凋亡指数(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4 免疫印迹技术测定大鼠视网膜组织Bcl-2、BAX及 Cleaved Caspase-3蛋白表达:根据蛋白提取试剂盒说明书提取大鼠视网膜组织总蛋白并以二喹啉甲酸定量后,根据参考文献[10]将蛋白样品进行电泳、转膜、封闭、一抗(Bcl-2、BAX、Cleaved Caspase-3抗体浓度1∶3000)孵育、二抗(1∶5000)孵育、ECL处理后,凝胶成像系统分析Bcl-2、BAX和Cleaved Caspase-3蛋白相对表达水平。

1.2.5 ELISA法检测大鼠视网膜组织IL-6、TNF-α和IL-1β表达水平:取部分视网膜组织,参考文献[11]加入组织裂解液,离心收集上清液,定量上清液蛋白后,按照ELISA检测试剂盒说明书检测大鼠视网膜组织中IL-6、TNF-α和IL-1β表达水平。

1.2.6 逆转录聚合酶链式反应检测大鼠视网膜组织中微小RNA(miR)-155和高迁移率族蛋白1(HMGB1)、晚期糖基化终产物受体(RAGE) mRNA表达水平:采用Trizol法提取视网膜组织总RNA,并采用酶标仪测定RNA浓度;根据逆转录试剂盒说明书进行逆转录后,根据参考文献[12]中的引物进行PCR扩增。其中,miR-155上游引物为5’-UGGGGAUAGUGUUAAUCGUAAUU-3’,下游引物为5’-UGGGGAUAGUGC UAAUCGUAAUU-3’;U6上游引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’;GAPDH上游引物为5’-GGAGTCTACTGGCGTCTT CAC-3’,下游引物为5’-ATGAGCCCTTCCACGATGC-3’;HMGB1上游引物为5’-GTGAGGGAGAGAGTGGGTAAA-3’,下游引物为5’-GCAATCTGAGACCAACCTCACT-3’;RAGE上游引物为5’-CGCCCAGGTCAAGATAGAGC-3’,下游引物为5’-CACCCCACCTGAGGACATTG-3。分别以U6和GAPDH为内参采用2-ΔΔCt法计算视网膜组织中miR-155和HMGB1、RAGE mRNA表达水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠血糖水平和视网膜组织中伊凡斯兰渗透量比较 模型组和对照组比较,大鼠血糖水平和视网膜组织中伊凡斯兰渗透量均明显升高(均P<0.05);且与模型组比较,芦丁低剂量组、芦丁中剂量组、芦丁高剂量组三组大鼠上述指标呈剂量依赖性降低(均P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血糖水平和视网膜组织中伊凡斯兰渗透量比较

2.2 各组大鼠视网膜神经节细胞凋亡情况比较 模型组和对照组比较,大鼠视网膜神经节细胞凋亡指数明显升高(P<0.05);且与模型组比较,芦丁低剂量组、芦丁中剂量组、芦丁高剂量组三组大鼠上述指标呈剂量依赖性降低(均P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠视网膜神经节细胞凋亡指数比较(%)

2.3 各组大鼠视网膜组织中BAX、Cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平比较 与对照组相比,模型组BAX和Cleaved Caspase-3表达水平均显著升高,Bcl-2的表达则显著降低(均P<0.05)。与模型组相比,芦丁低剂量组、芦丁中剂量组、芦丁高剂量组三组大鼠的 BAX和Cleaved Caspase-3表达水平呈浓度依赖性降低;相反,Bcl-2表达水平呈浓度依赖性升高(均P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠视网膜组织中BAX、Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平比较

2.4 各组大鼠视网膜组织中IL-6、TNF-α和IL-1β表达水平比较 与对照组比较,模型组大鼠视网膜组织中IL-6、TNF-α和IL-1β水平均明显升高(均P<0.05);与模型组比较,芦丁低剂量组、芦丁中剂量组、芦丁高剂量组大鼠上述指标均呈剂量依赖性降低(均P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠视网膜组织中IL-6、TNF-α和IL-1β表达水平比较(ng/g)

2.5 各组大鼠视网膜组织中miR-155和HMGB1、RAGE mRNA表达水平比较 模型组和对照组比较,大鼠视网膜组织中miR-155和HMGB1、RAGE mRNA水平均明显升高(均P<0.05);与模型组比较,芦丁低剂量组、芦丁中剂量组、芦丁高剂量组三组大鼠上述指标呈浓度依赖性降低(均P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠视网膜组织中miR-155和HMGB1、RAGE mRNA表达水平比较

3 讨 论

芦丁又名芸香苷、紫槲皮苷,是一种来源很广的黄酮类化合物,是一种生物活性很强、临床应用广泛的中药。大量研究发现芦丁的药理作用比较广泛,能够很好地抑制自由基活性,抑制脂质过氧化,抗病毒,还能够治疗急性胰腺炎,可以被广泛地应用在各种疾病上[13-15]。芦丁是一种具有抗氧化作用的自然产物,它具有多种药理学作用,如消炎、抗病毒、防治心脑血管病等。研究指出,芦丁可能是一种抑癌物质,可延缓大鼠癌症的发展同时减弱其炎症效应[16];此外芦丁在治疗溃疡性结肠炎小鼠的炎症效应方面显示出良好疗效,可显著降低模型小鼠的炎症因子表达[17]。

DR的发生、发展与炎症因子息息相关,通过药物治疗减轻炎性反应可有效控制糖尿病视网膜病变的进一步发展。当视网膜组织受到病理性刺激或损伤时,细胞间隙可能会扩大,导致注入的伊凡斯兰能够渗透到组织中。因此,伊凡斯兰渗透量可以用来间接评估视网膜组织的血管损伤程度,视网膜神经节细胞凋亡指数可用于评价神经节细胞凋亡程度。研究结果表明,经芦丁干预的三组大鼠血糖水平、组织蛋白含量、视网膜神经节细胞凋亡指数与未经芦丁干预的模型组大鼠相比明显下降,这代表芦丁干预可加速血糖代谢,减轻视网膜组织损伤。表明芦丁可通过抑制视网膜组织炎性反应和神经节细胞凋亡改善视网膜组织损伤,延缓DR。

Bcl-2为凋亡抑制因子,可与蛋白质发生二聚化,抑制细胞凋亡;BAX为促凋亡因子,可增加细胞色素 C释放,引起Caspase-9活化,进而引起其他Caspase家族成员的活化,引起细胞凋亡。当Caspase蛋白被活化时,其N-端前肽与较大亚基间的特异性位点发生水解,然后在较大亚基间裂开,释放较大的基团,从而生成具有较强生物活性的异源四聚物,这时Caspase-3会被一种外源蛋白质所剪切并活化[18-19]。研究发现,与未使用芦丁干预的模型组大鼠相比,三组经芦丁干预的大鼠促凋亡蛋白BAX、Cleaved Caspase-3表达下降,抗凋亡Bcl-2表达升高,表明芦丁可降低糖尿病大鼠促凋亡蛋白BAX、Cleaved Caspase-3表达,减少细胞凋亡。据此,我们推测:芦丁可能通过上调 BAX和抑制Bcl-2的表达,发挥其抗癌效应。

miR-155是一种重要的促炎miRNA,可通过抑制其表达减轻炎症,保护视网膜功能[20]。HMGB1/RAGE通路是一种与炎症、免疫应答和疾病发展密切相关的生物通路,当细胞受到损伤或感染时,HMGB1释放到胞外并与RAGE结合,导致免疫细胞的激活和炎症介质的释放,这一过程有助于免疫系统应对感染和损伤,但也可能导致慢性炎症和自身免疫疾病。HMGB1是一种重要的转录调节因子,可激活HMGB1/RAGE信号通路介导的炎性反应。被激活后可通过促进IL-6、TNF-α等炎症因子的表达加重病变部位的炎症损伤,还可上调BAX表达促进细胞凋亡,此外 HMGB1还可介导糖尿病视网膜血管病变与神经病变,并调控Caspase蛋白的表达[21]。RAGE是一种受体,它能够与HMGB1结合,触发细胞内信号传导通路,导致炎症和免疫应答。HMGB1是天然免疫受体中作用最强的一种蛋白,是炎症通路上游的重要的因子,可通过激活RAGE在DR进展中发挥着重要作用[22-25]。本研究结果显示miR-155、HMGB1、RAGE水平,以及IL-6、TNF-α、IL-1β炎症因子水平在糖尿病大鼠视网膜中升高,经芦丁干预后,以上指标均下降,炎性反应减轻,且下降水平与芦丁剂量呈相关性,表明芦丁干预可降低糖尿病大鼠视网膜组织中miR-155和HMGB1、RAGE mRNA表达,降低炎性因子水平,这提示芦丁可能通过抑制miR-155和HMGB1/RAGE通路,减轻视网膜组织炎性反应和凋亡,进而延缓DR。

综上所述,芦丁干预可改善DR大鼠视网膜细胞损伤,减轻炎性反应,延缓DR进展。其药理机制可能与抑制miR-155和HMGB1/RAGE通路激活,减少炎性因子释放有关。本研究为芦丁临床应用于延缓DR提供了理论依据,同时也为后期的新药靶点的选择提供见解,但是本次研究为动物实验,还需进一步研究探讨其作用机制与疗效。