何静子,穆其琛,付东阁,王碧延

(1.延安大学,陕西 延安 716099;2.又石大学,韩国 全州565701;3.延安大学附属医院,陕西 延安 716099)

多囊卵巢综合征(Polycystic ovarian syndrome,PCOS)多发于育龄期女性,发病后患者多会出现糖代谢异常、雄激素大量分泌等临床特征,是导致女性不孕的常见病、多发病[1-2]。相关报道认为PCOS在育龄期女性中的发病率处于5%～10%,但其发病机制目前尚未完全明确[3]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一种参与到细胞代谢、增殖、分化等多种生物学过程的非编码RNA,其长度超过200 bp,相关研究认为lncRNA异常与糖尿病、癌症及PCOS等疾病的发生密切相关[4]。lncRNA TMPO antisense RNA1(TMPO-AS1)位于12q23.1上,在肺癌细胞增殖、凋亡、侵袭等调控中具有重要意义[5]。但TMPO-AS1在PCOS发生、发展的调控作用尚未明确,且目前国内外也缺乏相关研究。磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(Protein kinase B,PKB)(因PKB是一种相对分子量约为6.0×104的Ser/Thr蛋白激酶,与PKA、PKC均有很高的同源性,该激酶被证明是反转录病毒癌基因v-Akt的编码产物,故又称Akt),PI3K/Akt信号通路目前被认为在多种肿瘤和炎性反应的发生发展中均能发挥出一定作用。近几年也有相关研究发现PI3K/Akt与PCOS的发生发展有关[6-7]。但TMPO-AS1是否调控PI3K/Akt信号通路而发挥作用尚未知。基于此,本文就lncRNA TMPO-AS1通过PI3K/Akt信号通路对PCOS大鼠性激素和卵巢功能的影响进行分析。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择30只SD雌性大鼠,体重180～220 g,购买于上海斯莱克动物实验有限公司,实验动物使用许可证SYXK(浙)2021-0012,正常条件下饲养1周,饲养条件:2～25 ℃,湿度70%,普通饲料喂养,自由摄食饮水、分笼喂养,每笼5只。

1.2 试剂、药物与仪器 脱氢表雄酮(Dehydro epiandrosterone,DHEA)(美国IL公司);注射用芝麻油(上海罗辅医药科技有限公司,批准文号F20180001661);FA2004N电子天平(菁海仪器有限公司);mRNA反转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司);荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒(杭州主诺生物技术有限公司);ES-300组织包埋机(上海聚慕医疗器械有限公司);5424R微型冷冻离心机、Premium U570立式超低温冰箱(德国 Eppendorf 公司);SH-2020全自动电泳系列[北京金桑特医用仪器技术开发有限公司,京药管械(准)字2003第1400072号] ;Trans Blot Cell蛋白转印系统(美国Bio-Rad 公司);WD-9413A型凝胶成像分析系统(上海析域仪器设备有限公司);DK-S26恒温水浴箱(上海精宏实验设备有限公司);兔抗PI3K、Akt抗体(英国Abcam公司,批号ab191606、ab182651);羊抗鼠IgG二抗(武汉艾美捷科技有限公司,批号A1937);增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)(上海赛信通生物试剂有限公司,批号42140);Western洗涤缓冲液(TBST)(北京百奥莱博科技有限公司);睾酮激素(Testosterone,T)、雌二醇(Estradiol,E2)、促卵泡生成激素(Follicle stimulating hormone,FSH)、促黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)酶联免疫吸附试剂盒(北京博奥森生物工程有限公司);ELX800酶标仪(美国BioTek公司);苏木素-伊红(Hematoxylin-yihong staining,HE)染色试剂盒(货号YT8991,北京伊塔生物科技有限公司);LEICA RM2135切片机(德国切片机Leica公司);OLYMPUS显微镜BX41型(日本Olympus公司)。

1.3 大鼠分组、模型制备及处理 参照文献[8]的方法制备大鼠模型,给予所有大鼠60%高脂饲料喂养,于皮下注射DHEA(6 mg/100 g),连续注射21 d,从第16天开始连续4 d观察大鼠阴道涂片,连续出现胶质细胞为造膜成功,成功后将大鼠分为模型组、si-NC组、TMPO-AS1-shRNA组。另选取10只正常大鼠作为空白对照组,普通饲料喂养,以等量豆油替代。

1.4 观察指标

1.4.1 体重、卵巢重量、卵巢指数:最后一次注射1 h后于天平上称每组大鼠的体重,并采用10%水合氯醛对所有大鼠进行麻醉,每100 g体重0.3 ml剂量麻醉,切除所有大鼠双侧卵巢,并将周边脂肪组织剔除,于天平上称重,并计算卵巢指数,卵巢指数=卵巢重量/体重。

1.4.2 RT-qPCR检测卵巢组织TMPO-AS1、PI3K、Akt mRNA相对表达量:取卵巢组织,Trizol一步法提取组织总RNA,紫外分光光度计(Thermo 2000D)测定浓度和纯度,逆转录为cDNA扩增,反应条件:95 ℃、30 s,95 ℃、5 s,60 ℃,扩增44 s,循环40个。内参为β-actin,2-ΔΔCt方法分析TMPO-AS1、PI3K、Akt相对表达量。TMPO-AS1上游引物:5’-TCAAACCCGTATTACCG-ATCCA-3’,下游引物:5’-ACCCTACATCCAAGGT-CTCCT-3’;PI3K上游引物:5’-CAAAGCCGAGAAC-CTATTGCGAG-3’,下游引物:5’-GTTTGACTTCG-CCATCTACCAC-3’;Akt上游引物:5’-GAGGTTG-CCCACACGCTTA-3’,下游引物:5’-GGCGTACTCCATGACAAAGCAG-3’。

1.4.3 Western blot检测卵巢组织PI3K、Akt蛋白表达水平:根据大鼠卵巢重量加入相应剂量的裂解液,制成10%匀浆,冰上裂解30 min,于4 ℃环境下离心(1200 r/min,10 min,半径9 cm),取上清液,根据相关说明书进行定量,确定上样量后制备凝胶,上10 μl样,跑胶,初始电压80 V,跑开后调为120 V;转膜(90 min),电流300 mA,封闭液封闭2 h;TBST洗膜10 min,重复3次;加一抗(PI3K稀释1∶1000,Akt稀释1∶10000),孵育过夜;重复洗膜3次,加二抗孵育2 h,重复洗膜3次,涂ECL发光液(A、B液1∶1)显影。

1.4.4 血清性激素指标检测:所有大鼠麻醉后通过腹主动脉穿刺法采集全血,于室温静至60 min后离心(1500 r/min,10 min,半径9 cm),取上清液置于-80 ℃冰箱保存待用,采用酶联免疫吸附法检测血清T、E2、FSH、LH水平。

1.4.5 卵巢形态学观察:剖开大鼠卵巢,置于10%甲醛溶液中固定(24～48 h),并行石蜡包埋,保存备用,随后行HE染色(10 min),自来水洗涤,并采用1%烟酸乙酯分化2 s,自来水洗涤,氨水洗2 s,洗掉浮色,HE染色2 min,置于无水乙醇孵育2 s,常规透明、封片、切片,取5个切片,于光镜下观察黄体数、成熟卵泡数、颗粒细胞厚层。黄体:类球体,体积增大,残留卵泡壁有明显塌陷,卵泡膜结缔组织进入颗粒层。成熟卵泡:有明显卵丘,卵泡腔较大,卵泡内膜细胞与卵泡颗粒层贴近,与颗粒层间存在较多毛细血管,外膜细胞处于外层,与周边结缔组织无明显界限。

2 结 果

2.1 四组大鼠卵巢组织TMPO-AS1、PI3K、Akt mRNA表达水平比较 模型组与si-NC组TMPO-AS1、PI3K、Akt mRNA水平比较无统计学差异(均P>0.05)。与空白对照组比较,模型组、si-NC组TMPO-AS1、PI3K、Akt mRNA水平较低;与模型组、si-NC组比较,TMPO-AS1-shRNA组TMPO-AS1水平低、PI3K、Akt mRNA水平较高,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 四组大鼠卵巢组织TMPO-AS1、PI3K、Akt mRNA表达水平比较

2.2 四组大鼠体重、卵巢重量、卵巢指数比较 模型组与si-NC组体重比较无统计学差异(P>0.05)。与空白对照组比较,模型组、si-NC组、TMPO-AS1-shRNA组体重、卵巢重量、卵巢指数较高;与模型组、si-NC组比较,TMPO-AS1-shRNA组体重、卵巢重量、卵巢指数较低,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 四组大鼠体重、卵巢重量、卵巢指数比较

2.3 四组大鼠卵巢组织PI3K、Akt蛋白表达水平比较 模型组与si-NC组PI3K、Akt蛋白表达水平比较无统计学差异(均P>0.05)。与空白对照组比较,模型组、si-NC组、TMPO-AS1-shRNA组PI3K、Akt蛋白表达水平较低;与模型组、si-NC组比较,TMPO-AS1-shRNA组PI3K、Akt蛋白表达水平较高,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

表3 四组大鼠卵巢组织PI3K、Akt蛋白表达水平比较

2.4 四组大鼠血清性激素水平比较 模型组与si-NC组T、E2、FSH、LH水平比较无统计学差异(均P>0.05)。与空白对照组比较,模型组、si-NC组、TMPO-AS1-shRNA组T、LH水平较高,E2、FSH水平较低;与模型组、si-NC组比较,TMPO-AS1-shRNA组T、LH水平较低,E2、FSH水平较高,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表4。

表4 四组大鼠血清性激素水平比较

2.5 四组大鼠卵巢形态学比较 模型组与si-NC组黄体数、成熟卵泡数、颗粒细胞厚层比较无统计学差异(均P>0.05)。与空白对照组比较,模型组、si-NC组、TMPO-AS1-shRNA组黄体数、成熟卵泡数、颗粒细胞厚层较低;与模型组、si-NC组比较,TMPO-AS1-shRNA组黄体数、成熟卵泡数、颗粒细胞厚层较高,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表5。

表5 四组大鼠卵巢形态学比较

3 讨 论

PCOS的发生发展可能与胰岛素抵抗(IR)、内分泌代谢紊乱、血脂异常等因素有关,近几年在我国的发病率呈逐年上升趋势,尽早明确PCOS发生发展的分子机制,并确认其发病的直接靶蛋白,在寻找精确的PCOS治疗方法方面意义重大[9]。lncRNA具有空间结构多样、功能复杂、序列长等特点,在转录和翻译中均具有重要作用,目前国内外有不少研究发现多种lncRNA与PCOS发生发展关系密切,其中李永乐等[10]就发现外周血lnc-NTF3-5在PCOS中表达上调,且通过影响PCOS患者体内炎性反应和性激素分泌的方式还能在IR中发挥重要作用。吴镔莎等[11]也发现,包含显著上调的11种lncRNA和显著下调的8种lncRNA的数据集可以成功区分PCOS患者和健康人群。祁彦萍等[12]则表明,lncRNA GAS5过表达可通过靶向调控miR-21表达的方式对卵巢颗粒细胞增殖进行抑制,进而促使细胞凋亡。以上研究均为PCOS发生发展的诊断及治疗提供了新方向。但目前仍有部分lncRNA在PCOS发生发展的作用尚未阐明,因此继续挖掘lncRNA分子并探讨其与PCOS生物学行为的相关性,对提升PCOS治疗效果及改善预后等方面均具有重要意义[13]。

TMPO-AS1作为反转录本1,广泛参与了调控细胞的增殖过程,相关研究报道lncRNA TMPO-AS1是一种与恶性肿瘤密切相关的lncRNA,在多种恶性肿瘤中均能充当癌基因[14]。但目前对于lncRNA TMPO-AS1在PCOS发生发展中的研究较为缺乏。本次研究通过RT-qPCR检测发现,模型组、si-NC组TMPO-AS1、PI3K、Akt mRNA水平均比空白对照组低。这与ZHAO等[15]关于lncRNA TMPO-AS1在卵巢癌表达中上调,可促进LCN2转录活性并在卵巢癌中发挥致癌功能的研究相符。提示TMPO-AS1、PI3K/Akt可能在PCOS发生发展中发挥一定作用。而PI3K/Akt信号通路目前已被证实广泛参与到细胞的增殖、分化和凋亡等过程中,是维持始基卵泡生长、发育和凋亡的重要机制,其在促进卵泡颗粒细胞增殖和凋亡方面也能发挥出一定作用[16]。一旦PI3K被激活,可促使依赖磷酸酰肌醇的激酶变构并激活,进而激活靶蛋白Akt,而胰岛素能够促进子宫内膜细胞和癌细胞增殖,一旦胰岛素受体β亚基的酪氨酸激酶活化,胰岛素受体底物将会被激活,并进一步激活PI3K通路,PI3K通路激活后,Akt多个残基的磷酸化位点也会出现磷酸化并激活Akt,进而促进卵泡膜细胞增生,或出现卵泡发育异常、无排卵等PCOS临床症状[17-18]。尹丽红等[19]的研究也发现PI3K/Akt信号通路相关蛋白在PCOS伴IR大鼠中的表达异常,证实了PI3K/Akt信号通路过度表达参与了PCOS的发生发展过程,与本次研究结果一致。此外,PI3K/Akt信号通路与卵巢颗粒细胞自噬存在一定关联,PI3K/Akt信号通路一旦受到抑制将无法调控卵巢颗粒细胞自噬过程,进而引起卵泡锁闭,从而影响机体卵巢功能,导致性激素紊乱[20-21]。XIE等[22]的研究发现,通过PI3K/Akt途径调节DHEA诱导的PCOS自噬,可在一定程度上改善卵巢功能障碍,揭示了PCOS的潜在药物靶点,这为PCOS提供了新的治疗方向。本次研究结果显示,TMPO-AS1-shRNA组的体重、卵巢重量、卵巢指数和T、LH水平均比模型组、si-NC组低;PI3K、Akt、E2、FSH水平和黄体数、成熟卵泡数、颗粒细胞厚层均比模型组、si-NC组高。刘菏婧等[23]也发现上调PI3K/Akt信号通路在改善PCOS-IR大鼠性激素、多囊卵巢和胰岛素抵抗状态等方面具有重要意义,与本次研究结果相似。这说明PCOS可能导致局部卵巢组织PI3K/Akt信号通路相关重要信号传导分子基因表达量紊乱,而lncRNA TMPO-AS1可重新上调PI3K、P-PI3K、Akt、P-Akt基因表达,有利于促使卵巢功能恢复正常,进而改善卵巢形态和性激素紊乱状态[24-25]。但本次研究纳入样本量较小,且受地域、PCOS诊断等因素的影响,研究结果可能存在偏差,其具体调控机制还有待进一步深入研究。

综上所述,lncRNA TMPO-AS1在PCOS发生发展具有重要意义,通过PI3K/Akt信号通路有利于调节PCOS性激素水平,并增强卵巢功能。