韦 敏,顾春梅,管燕华,王育新

(南京大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科,江苏 南京 210008)

口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,是发生于口腔内恶性肿瘤的总称,包括舌癌、牙龈癌、颊黏膜癌、唇癌及颌骨癌等。我国口腔癌年龄标准化发病率为2.44%,年龄标准化病死率为1.09%,且呈逐年迅速递增趋势,5年生存率低下,严重危害人类健康[1]。当前常用的抗口腔癌药物治疗效果均不甚理想[2]。因此探索口腔癌增殖和转移的分子标记对于口腔癌的治疗十分必要。转化生长因子β(Transforming growth factor β,TGF-β)/Smad信号通路在上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)中发挥重要作用。已有报道指出通过调节TGF-β/Smad信号通路可调控口腔癌细胞的EMT过程,最终调节口腔癌细胞的侵袭和转移[3],并且有研究发现TGF-β/Smad信号通路在口腔癌细胞的增殖过程中也发挥重要作用[4]。近年来研究发现微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)与口腔癌的发生发展密切相关。有研究指出miR-21在口腔癌中高表达,可作为口腔癌诊断的潜在分子标记,miR-21表达上调与不良预后密切相关[5],能够促进口腔癌细胞的侵袭和迁移[6]。也有研究表明miR-21可靶向TGF-β/Smad信号通路中的负反馈调节因子Smad7,调节肺腺癌细胞的增殖[7]。然而miR-21能否通过介导Smad7调控TGF-β/Smad信号通路抑制口腔癌细胞的恶性生物学行为尚不清楚。本研究选取人口腔癌细胞株HSQ-89开展体外细胞实验,探究miR-21介导Smad7调节TGF-β/Smad信号通路调控人口腔癌细胞株HSQ-89增殖、侵袭、迁移的作用与可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人口腔癌细胞株HSQ-89(河南省工业微生物菌种工程技术研究中心,BNCC100601);脂质体(Lipofectamine 2000)转染试剂盒(赛默飞,11668);阴性对照(NC inhibitor,合成序列:5’-CAGUACUUUUGUGUUGUAGUAC-3’)质粒(pGFP-NC inhibitor)、miR-21抑制剂(miR-21 inhibitor,合成序列:5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’)质粒(pGFP-miR-21 inhibitor)、miR-21模拟物(miR-21 mimics,合成序列:正义链5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’,反义链5’-ACUGAAUCAUGGCAUCUGAUGC-3’)质粒(pGFP-miR-21 mimics)、NC mimics(合成序列:正义链5’-UGUAUACGAUCAUUACAUUUAG-3’,反义链5’-UCACAGUACUUAUGCUCAGCUU-3’)、野生型和突变型Smad7-3非翻译区(UTR)报告基因质粒(野生型pMIRGLO-Smad7、突变型pMIRGLO-Smad7)(由百奥迈科生物技术有限公司构建与合成);细胞计数(CCK-8)试剂盒[吉满生物科技(上海)有限公司,GM-040101];侵袭小室(Transwell)、基质胶(美国康宁,3422、354234);结晶紫染色液(北京索莱宝科技有限公司,G1062);RNA提取试剂盒(赛默飞,CS14010);miR-21、U6、TGF-β1、Smad3、Smad7、细胞周期蛋白(CCND1)、MYC、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2),β-肌动蛋白(β-actin)聚合酶链反应(PCR)引物(由上海生工有限公司合成);总蛋白提取试剂盒(艾美捷科技有限公司,AMJ-KT0007);核蛋白提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,R0050);一抗和酶标记的二抗(北京达科为生物技术有限公司,A2124、ab84177、ab193297、A16396、P24385、ab152146、A20798、ab137321、ab97779、ab119716;ab7090、ab97080、ab97200、AS014、AS063、ab205718、ab97051、ab97023、ab97195、ab7171);双荧光素酶报告基因检测试剂盒[威格拉斯生物技术(北京)有限公司,T002];倒置显微镜(日本奥林巴斯,CKX41);酶标仪(赛默飞,MK3);PCR仪器(美国ABI,7500);高速冷冻离心机(贝克曼,Avanti JXN-30);电泳仪(南京威美特科学仪器有限公司,AD99-DYY-11)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞处理:常规培养人口腔癌细胞株HSQ-89,待细胞融合度达80%时进行传代培养。取对数生长期细胞,严格按照Lipofectamine 2000操作说明将pGFP-NC inhibitor、pGFP-miR-21 inhibitor、pGFP-miR-21 mimics转染至人口腔癌细胞株HSQ-89,设为阴性对照组、下调组与上调组;正常组添加等量无菌蒸馏水,各5个复孔。培养48 h。

1.2.2 细胞增殖能力检测:培养48 h后,对细胞消化,将细胞悬液(2×104个/ml)接种培养,待细胞基本完全贴壁,每孔加10 μl CCK-8溶液,常规培养6 h后450 nm处测定光密度值。

1.2.3 细胞侵袭能力检测:培养48 h后,制备细胞悬液(1×106个/ml),向预铺基质胶的Transwell小室上室加200 μl细胞悬液,下室加400 μl培养基。常规培养24 h,固定,结晶紫染色,15 min后观察。

1.2.4 细胞迁移能力检测:培养48 h后,将细胞接种培养,待贴壁后采用无菌枪头对孔内细胞做划痕,磷酸盐缓冲液冲洗细胞。划痕愈合率为0 h与48 h划痕宽度差值与0 h划痕宽度比值,计算百分比。

1.2.5 各组细胞基因表达检测:培养48 h后,提取各组总RNA,反转录,设计引物序列,见表1。扩增流程:94 ℃、60 s,92 ℃、45 s,56 ℃、30 s,72 ℃、30 s,连续进行35个循环。miR-21内参为U6,其余均为β-actin,计算2-ΔΔCt。

表1 引物序列

1.2.6 TGF-β1、Smad3、Smad7、CCND1、MYC、E-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白及p-Smad3水平检测:培养48 h后,裂解细胞,并抽提总蛋白。4 ℃、12000 r/min(有效离心半径10 cm)离心5 min,收集上清、定量。电泳分离,转膜后封闭。按说明书加入一抗、二抗,反应后曝光观察。其中p-Smad3选取H3为内参基因,其余选取β-actin为内参基因。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测验证miR-21是否靶向Smad7:采用Target Scan 8.0[8]预测两者结合位点。将野生型和突变型pMIRGLO-Smad7报告基因质粒分别与miR-21 mimics和NC mimics共转染至人口腔癌细胞株HSQ-89。转染24 h后,检测各组细胞相对荧光强度。

2 结 果

2.1 各组细胞增殖能力比较 上调组细胞增殖活性较正常组和阴性对照组上升,下调组细胞增殖活性下降(均P<0.01);与上调组比,下调组细胞增殖活性下降(P<0.01)。见表2。

表2 各组细胞增殖活性比较

2.2 各组细胞侵袭能力比较 上调组细胞侵袭细胞数较正常组和阴性对照组增加(均P<0.01),下调组细胞侵袭细胞数减少(P<0.01);下调组细胞侵袭细胞数则较上调组减少(P<0.01)。见表3。

表3 各组细胞侵袭能力比较(个)

2.3 各组细胞迁移能力比较 上调组细胞划痕愈合率较正常组和阴性对照组上升(P<0.01),下调组细胞划痕愈合率下降(P<0.01);与上调组比,下调组细胞划痕愈合率下降(P<0.01)。见表4。

表4 各组细胞划痕愈合率(%)

2.4 各组细胞miR-21、TGF-β1、Smad3、Smad7、CCND1、MYC、E-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA相对表达量比较 上调组细胞miR-21、TGF-β1、Smad3、CCND1、MYC、Vimentin、MMP-2 mRNA表达较正常组和阴性对照组上升、Smad7和E-cadherin表达下降(均P<0.05或P<0.01),下调组细胞miR-21表达、TGF-β1、Smad3、CCND1、MYC、Vimentin、MMP-2 mRNA表达下降(均P<0.01)、Smad7和E-cadherin表达上升(均P<0.05或P<0.01);与上调组比较,下调组细胞miR-21表达、TGF-β1、Smad3、CCND1、MYC、Vimentin、MMP-2 mRNA表达下降(均P<0.01)、Smad7和E-cadherin表达上升(均P<0.01)。见表5。

表5 各组细胞miR-21、TGF-β1、Smad3、Smad7、CCND1、MYC、E-cadherin、Vimentin、MMP-2 mRNA相对表达量比较

2.5 各组TGF-β1、Smad3、Smad7、CCND1、MYC、E-cadherin、Vimentin、MMP-2蛋白及p-Smad3表达水平比较 上调组细胞TGF-β1、Smad3、CCND1、MYC、Vimentin、MMP-2蛋白表达和p-Smad3水平均较正常组和阴性对照组上升、Smad7和E-cadherin表达下降(均P<0.05或P<0.01),下调组细胞TGF-β1、Smad3、CCND1、MYC、Vimentin、MMP-2蛋白表达下降、Smad7和E-cadherin蛋白表达上升(均P<0.05或P<0.01);与上调组比,下调组细胞TGF-β1、Smad3、CCND1、MYC、Vimentin、MMP-2蛋白表达和p-Smad3水平均下降(均P<0.01)、Smad7和E-cadherin蛋白表达上升(P<0.01)。见表6。

表6 各组蛋白表达及磷酸化水平比较

2.6 miR-21靶向Smad7验证结果 Targetscan 8.0数据库预测Smad7为miR-21潜在靶基因。miR-21与Smad7的3’UTR区碱基互补配对,见图1。野生型共转染miR-21 mimics组相对荧光强度低于共转染NC mimins组(P<0.01),而突变型两组比较差异无统计学意义(P>0.05),见图2。

图1 Smad7为miR-21潜在靶基因

注:与NC mimics组比较,**P<0.01

3 讨 论

口腔癌是发生于口腔黏膜组织的恶性肿瘤,发病原因主要包含不良生活方式、环境因素、生物以及遗传因素等[9-10]。目前临床上主要选取手术治疗及放化疗辅助方案,但存在耐药性及严重的不良反应等问题,严重限制抗肿瘤药物在临床上的使用[11-12]。而口腔癌因癌细胞的转移进一步危害人类身体健康,故需探讨抗口腔癌的新靶点。

本研究结果表明miR-21在口腔癌细胞增殖、侵袭和迁移过程发挥促进作用。EMT在口腔癌细胞的侵袭和转移过程至关重要,有研究表明miR-21可调控卵巢癌细胞的EMT过程促进卵巢癌进展[13],推测miR-21可能是一种重要的致癌分子。miRNA参与调控细胞的增殖、分化及凋亡过程,作为抑癌基因或致癌基因在肿瘤发生发展过程发挥关键作用。miR-21在多数常见恶性肿瘤中过表达,发挥致癌功能,LIN等[14]指出miR-21在膀胱癌细胞中高表达,转染miR-21后促进膀胱癌细胞的增殖、侵袭和迁移;TSE等[15]通过构建体内肿瘤实验指出miR-21拮抗剂可改善荷瘤小鼠的肿瘤负担,抑制miR-21表达可抑制胃癌细胞的EMT过程,发挥促癌作用;CHEN等[16]指出miR-21在口腔癌细胞中高表达,在口腔癌细胞的增殖和侵袭过程中发挥促进作用。本研究与上述结果一致,提示miR-21可能是一种致癌分子,表明可将其作为口腔癌的肿瘤标志物及抗癌靶点。

本研究中上调miR-21表达可抑制Smad7表达,促进TGF-β1、Smad3、CCND1、MYC、Vimentin、MMP-2表达,抑制E-cadherin表达,有致癌成效,miR-21可调控Smad7。在恶性肿瘤晚期,TGF-β/Smad信号通路发挥促进肿瘤EMT从而促进肿瘤转移[17]。ZHANG等[18]指出抑制TGF-β/Smad信号通路,抑制TGF-β1和Smad3的表达,可抑制与EMT过程相关的Vimentin表达,促进E-cadherin表达,抑制MMP-2表达,从而抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移;刘红艳等[19]指出抑制TGF-β/Smad信号通路及CCND1和MYC的表达,可调节结肠癌细胞的增殖。本研究与上述结果一致,这说明可通过调控TGF-β/Smad信号通路影响其下游分子表达,从而发挥抗口腔癌的作用。另外Smad7作为TGF-β/Smad信号通路的负反馈调节因子也可发挥促癌作用,与EMT有关[20]。THAKUR 等[21]指出沉默Smad7后可增强TGF-β/Smad信号通路所诱导的前列腺癌细胞的侵袭和迁移能力;顾海波等[22]指出促进Smad7表达可抑制TGF-β/Smad信号通路,抑制EMT发挥抗癌效应。TANG等[23]指出miR-21靶向Smad7促进肺癌细胞增殖、侵袭和迁移;HE等[24]指出通过调控miR-21对Smad7的靶向作用可调节胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。也有研究[25]证实,下调Vimentin表达、上调E-cadherin表达具有抗癌作用,提示这是控制癌细胞迁移、侵袭能力的重要途径。本研究结果与上述研究结果均一致,推测miR-21可能通过调节Smad7,调控TGF-β/Smad信号通路,参与口腔癌发生及其细胞的恶性生物学行为。

综上所述,miR-21可促进口腔癌细胞增殖、侵袭和迁移,可能通过调节Smad7,激活TGF-β/Smad信号通路,参与口腔癌发生,而抑制miR-21表达则能控制口腔癌细胞增殖、侵袭和迁移活性。然而本研究仍存在不足:miR-21是否受其他分子调控进而参与口腔癌的发生和发展尚不明确;miR-21是否可通过其他分子途径参与口腔癌并不清楚;下调miR-21表达抗口腔癌在临床中应用的可行性还属未知;miR-21与口腔癌病理特征及预后的关系还需进一步探讨。后续应重点研究上述问题,方能实施新的靶向治疗方法以减轻口腔癌患者的痛苦、改善其预后。