王佳琪

(呼伦贝尔市农畜产品质量安全中心/呼伦贝尔市农牧业检验检测中心，内蒙古 呼伦贝尔 021000)

引言

有机磷农药自开发应用以来对世界范围内的农业生产无疑产生了巨大的推动作用，但是在促增产保丰收的背后却对自然环境和人类健康产生了巨大的危害。随着该类农药的使用，类似于“毒韭菜”“毒李子”的有机磷农药中毒事件时有发生。在现实中有机磷中毒症状具有发病急、毒死率高的特点，而数据显示在每年的中毒病例中急性有机磷中毒，占到20%～50%，死亡率达到3%～40%[1]。另外，为应对农业种植过程中不合理使用有机磷农药，造成的潜在中毒风险，各基层农畜产品质量安全检测站通常使用农药残留速测试剂盒进行，这种基于酶抑制法的速测试剂盒，优点在于快速、灵敏、效率高，但对检测条件要求较为严格，会出现假阳性和假阴性的可能[2]。因此，通过研究不同物种AChE与各类有机磷农药的分子对接模型，分析结合模式和结合能的大小，找到普适性和强结合力的潜在结合位点或潜在定点突变位点，这对有机磷农药速测寻找新酶源和有机磷农药急性中毒治疗中新型解毒剂的研制具有现实意义和理论指导意义。当前农药快速检测所用的酶抑制法，其检测用酶的灵敏度是检测准确度的关键。而这类酶源主要集中在猪肝、鸡血等动物组织以及玉米、小麦等植物组织当中。随着研究的深入，也有从烟草天蛾、棉铃虫等昆虫体内提取。有研究显示，从家蝇中提取的酶在进行农药残留快速检测中表现出最优的检测效果[3]。另外，AChE的抑制剂主要有治疗阿尔兹海默症的药物他克林(Tacrine)等，以及农业上常用的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂，而有机磷农药直接或间接造成中毒案例在我国的数目非常巨大。其毒理作用表现为AChE被有机磷农药磷酸化，这种磷酸化具有不可逆的特点，因此导致体内乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)不能分解成胆碱和乙酸，从而ACh在体内大量蓄积，最终产生严重的中毒症状。临床上治疗急性有机磷农药中毒的药物有抗胆碱能药如阿托品、盐酸戊乙奎醚，而前者毒副作用大，后者起效慢，对于重度有机磷农药中毒患者不适用[4]；肟类复能剂如碘解磷定和氯解磷定，但有报道称氯解磷定对甲胺磷中毒抢救效果显著，对其他有机磷农药中毒救治效果不理想。但无论是哪类药物都是基于AChE的结构基础，利用基团竞争机制来发挥作用。与大部分分子对接研究相似，本研究将1/2的工作量放到了同源建模等前期基础性工作上，一个质量过关的模建蛋白对于后期分子对接研究非常重要。另外，有学者研究了32个物种的AChE与9种有机磷和氨基甲酸酯农药的分子对接相互作用[5]，还有学者研究了毒死蜱与电鳗、人类、果蝇和家鼠的AChE间的相互作用[6]。而本研究尽可能多的覆盖到了25种农业上常用的有机磷农药和覆盖半翅目、双翅目、鳞翅目和鞘翅目等11个目的30个物种的AChE之间的分子对接研究，基于DS 2019的半柔性对接模块，更全面的研究分子层面中不同物种与不同有机磷农药之间的相互作用。以绿盲蝽等30个物种的AChE模建蛋白和乙酰甲胺磷等25种有机磷农药分子为研究对象，立足于半柔性分子对接基础上，通过对比结合能(Binding Energy)大小、三维对接空间构象分析以及非键相互作用力分析，研究受体蛋白与配体分子间的相互作用力类型，关键氨基酸残基结合位点等结合机制，为有机磷农药快速检测筛选新酶源以及有机磷农药中毒新型解毒剂的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 同源建模

随着测序技术的发展，大量物种的AChE的蛋白质结构被解析出来，但其三维结构的探究却由于技术和资金的限制而少见。同源建模作为一种计算机辅助手段利用已知三维结构的AChE为模板构建未知结构的AChE，在药物虚拟筛选和新酶源发掘中却常见。本研究从NCBI和Uniport网站检索得到30个物种的AChE氨基酸序列，并将FASTA格式的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服务器，通过序列比对找到同源性大于30%的7个已知三维结构的蛋白晶体。并在ProteinDataBank数据库下载下列蛋白晶体：黑腹果蝇(PDB ID：6XYS、1QO9)、冈比亚按蚊(PDB ID：6ARX、6ARY、5YDH、5X61)、人(PDB ID：7D9O)，详见表1，并以此为模板在SWISS-MODEL在线服务器进行同源建模。

表1 同源建模信息表

1.2 模型质量评估

分子对接技术的基础是拥有一个质量可靠的受体蛋白，因此同源建模模型构建完成后，对模型的结构合理性进行评估是必不可少的。利用UCLA-DOELAB-SAVESv6.0在线服务器的ERRAT[7]、Verift-3D[8]和PROCHECK[9]3个模块进行模型质量评估。

ERRAT计算0.35nm范围之内，不同的原子类型对之间形成的非键相互作用的数目(侧链)。以得分的方式评价结构合理程度大于85较好，一般情况下得分在91分左右的结构都是可接受的。

Verift-3D是根据数据库已有蛋白质晶体结构的氨基酸位置以及α螺旋、β折叠、无规则卷曲和一些loop来评估目标模型和一级序列的相容性。超过80%的残基拥有大于0.1的3D/1D值，则模型质量合格，获得PASS，即为通过评估[10]。

PROCHECK以PDB中高分辨的晶体结构参数为参考，通过测评三维立体化学结构中的氨基酸残基角度是否合理来评价蛋白模型的合理性，结果以Ramachandran plot(拉马钱德兰图)显示。拉氏图将模型氨基酸划分为4个区域，包括核心区，又叫最佳合理区(The most favored regions)、允许区(The additional allowed regions)、大致允许区(The generous allowed regions)和禁阻区(The disallowed regions)，当不低于90%的氨基酸分布在允许区时，即为合理分布[11-13]。

1.3 分子对接

通过ZINC15在线检索器选取25种有机磷农药作为配体分子，并下载其二维分子结构式，并以“.mol”格式保存。在Chem 3D软件中生成三维立体结构，导入Discovery Studio 2019软件中优化分子构象、能量最小化和赋予CHARMm力场。

将同源建模得到的30个蛋白模型作为受体蛋白导入Discovery Studio 2019软件中，利用Prepare Protein功能进行加氢、补全残基、调整二面角、完善原子距离和赋予力场等自动优化程序。接着通过序列比对找到各物种AChE的催化三联体(SER、HIS、GLU)，再以三联体为中心15Å为半径的球形范围作为活性中心，利用Flexible Docking模块通过半柔性对接方式将配体分子对接到受体蛋白的活性中心上，结果以结合能(Binding energy)值的大小来评价，最终选取结合能最小以及构象最稳定的组合进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 各物种乙酰胆碱酯酶的同源建模

从生物信息学角度看氨基酸序列同源性越高，则蛋白质三维结构的空间结构越具有相似性。因此，将目标氨基酸序列提交到SWISS-MODEL在线服务器通过序列比对的方式找到一致性大于30%，并且序列覆盖度足够大的蛋白晶体作为模板蛋白，对于后续分子对接研究具有可靠性。而在实际操作中，模板蛋白与目标蛋白一致性最高达到98.97%，最低也有54.19%，利用Discovery Studio 2019软件将同源建模得到的蛋白质三维结构与模板蛋白进行结构叠合结果如图1所示，列举a、b、c和d为序列一致性从高到低的4个模建蛋白和模板蛋白的叠合结果，从结果看蛋白质的结构包括催化三联体高度重合，表现出保守性。而各别蛋白结构LOOP表现为个体差异，但远离活性中心。

注：a、b、c、d分别是一致性从高到低拟果蝇(98.97%)、印度跳蚁(70.7%)、二斑叶螨(54.19%)、伊氏叶螨(54.19%)的建模蛋白与模板蛋白的叠合视图，活性中心氨基酸以球状表示，其余氨基酸以带状表示。

2.2 模建蛋白质量评估

SAVES服务器提供了ERRAT、Verify-3D、PROVE、WHATCHECK、PROCHECK等5个质量评估程序，通常超过3个程序获得PASS结果则该蛋白结构即为合理可靠，可进行下一步分子对接研究。本研究利用SAVES服务器的ERRAT、Verift-3D和PROCHECK程序对不同物种AChE同源模建蛋白进行立体化学、序列和结构的匹配度等方面的合理性评估。其中ERRAT程序以85%、Verift-3D以80%、PROCHECK以90%为质量合格标准，通过评估所有30个物种的AChE同源模建蛋白质量均达到合格标准，如图2所示。

图2 30个物种AChE模建蛋白在ERRAT、Verift-3D和PROCHECK程序中质量评估表现

为展示模型在评估软件中的质量表现，选则与模板蛋白相似性为54.19%的伊氏叶螨乙酰胆碱酯酶(TeAChE)模建蛋白在不同程序中的评估结果如图3所示，拉氏图结果显示落在最佳合理区的氨基酸占88.2%，落在允许区氨基酸占11.1%，大致允许区占0.4%，有99.7%的氨基酸分布在允许区，说明蛋白模型较为合理。而ERRAT和Verift-3D打分结果分别是87.582%、87.62%，进一步证明了模建蛋白构建的可靠性。

图3 伊氏叶螨乙酰胆碱酯酶(TeAChE)模建蛋白在ERRAT、Verift-3D和PROCHECK程序中质量评估结果

2.3 分子对接结果

分子对接结果以受体蛋白和配体分子间的结合能(Binding energy)值的大小来评价，结合能值越小二者结合的越紧密[5]。如图4所示，大部分物种的AChE对有机磷农药都表现出敏感性，但是从敏感趋势上来看绝大部分物种对乙酰甲胺磷(Acephate)、敌敌畏(Dichlorvos)、马拉硫磷(Malathion)、久效磷(Monocrotophos)、二溴磷(Naled)和氧乐果(Omethoate)表现出强亲和力，总结合能在-1700kcal·mol-1以上，而对涕灭威(Carbanolate)、地虫磷(Fonofos)、甲基对硫磷(Methyl_parathion)、八甲磷(Schradan)和特丁硫磷(Terbufos)表现出弱亲和力，总结合能在-690kcal·mol-1以下。另外，黑尾叶蝉和二斑叶螨的乙酰胆碱酯酶与甲基对硫磷(Methyl_parathion)、胺磷(Phosphamidon)和八甲磷(Schradan)未体现出非键相互作用力，从三维空间对接构象分析是由于这3种有机磷分子没有完全包埋在活性中心空腔里。

图4 25种有机磷农药与30个物种乙酰胆碱酯酶分子对接结合能结果

为了从结构方面充分了解各物种与有机磷农药的具体相互作用，本研究从半翅目、双翅目、鳞翅目、同翅目、鞘翅目等11个目的30个物种中挑选出斜纹夜蛾、三化螟(鳞翅目)和桔小实蝇、家蝇(双翅目)4个物种的AChE与有机磷农药分子对接结合能最高的模型进行三维空间构象和非键相互作用力的分析。

利用DS 2019的Ligand Interactions和Show 2D Diagram模块分析家蝇AChE和二溴磷的结合模式以及非键相互作用力如图5所示，对接结果的三维模式显示二溴磷(Naled)分子完全包埋在受体蛋白的活性位点空腔之内，另外TYR151、GLY228、HIS557 3个氨基酸主要通过氢键与配体相互作用，而Trp163、Phe407、Trp447、Phe448与配体分子产生疏水相互作用。其中，属于催化三联体成员的HIS557与配体分子同时形成传统氢键、碳氢键和疏水相互作用力，氢键键长1.26Å，一般而言氢键键长在2Å以下被认为是强氢键，由此可知该氨基酸对于受体蛋白和配体分子之间的强结合能贡献值较大。

图5 家蝇乙酰胆碱酯酶与二溴磷的结合模式和相互作用力

桔小实蝇AChE与敌敌畏(Dichlorvos)的结合模式和相互作用力如图6所示，对接结果的三维模式显示敌敌畏(Dichlorvos)分子完全包埋在受体蛋白的活性位点空腔之内，GLY203、SER290和HIS532主要通过氢键与配体相互作用，而TYR126、TRP138、ALA291、TRP323、LEU380、PHE382、TYR422、PHE423、PHE492等9个氨基酸与配体产生疏水相互作用。属于催化三联体成员的HIS532同时与配体分子形成传统氢键和疏水相互作用力，氢键键长1.62Å。

图6 桔小实蝇乙酰胆碱酯酶与敌敌畏的结合模式和相互作用力

三化螟AChE与乙酰甲胺磷(Acephate)的结合模式和相互作用力如图7所示，对接结果的三维模式显示乙酰甲胺磷(Acephate)分子完全包埋在受体蛋白的活性位点空腔之内，GLY232、GLY234、SER314、HIS554主要通过氢键与配体相互作用，TRP443和ALA555 2个氨基酸与配体产生疏水相互作用，而TRP199通过Pi-Sulfur键和疏水相互作用于配体分子。值得注意的是，催化三联体成员的HIS554与配体分子同时产生传统氢键、Pi-Sulfur键和疏水相互作用，其中氢键键长2.46Å。另外，GLY234与配体分子以氢键产生相互作用，键长3.06Å。

图7 三化螟乙酰胆碱酯酶与乙酰甲胺磷的结合模式和相互作用力

斜纹夜蛾AChE与久效磷(Monocrotophos)的结合模式和相互作用力如图8所示，对接结果的三维模式显示久效磷(Monocrotophos)分子完全包埋在受体蛋白的活性位点空腔之内，GLY231、TYR233、TYR244和HIS553主要通过氢键与配体分子相互作用，TYR235、TYR442、PHE443和ALA554等4个氨基酸与配体分子形成疏水相互作用。催化三联体成员HIS553与配体分子同时形成传统氢键和疏水相互作用，氢键键长2.9Å。另外，TYR244与配体分子形成键长为2.24Å、2.64Å的2条碳氢键和键长为2.35Å的1条传统氢键，这对于提升受体蛋白和配体分子的亲和力来说贡献显著。

图8 斜纹夜蛾乙酰胆碱酯酶与久效磷的结合模式和相互作用力

3 讨论

本研究利用同源建模和分子对接技术研究了30个物种的乙酰胆碱酯酶和25种有机磷农药分子间的相互作用，结果显示绝大部分物种的AChE对25种有机磷农药都有亲和力，仅个别有机磷农药对某些物种未体现出对接构象，如黑尾叶蝉和二斑叶螨AChE与甲基对硫磷(Methyl_parathion)、胺磷(Phosphamidon)等，说明相较而言这些物种对这几种有机磷农药敏感性较低，从结构上来说利用定点突变来提高这些物种对各类有机磷农药的敏感性，对于发掘有机磷快检新酶源有很大空间。从分子对接空间构象上看，各物种与有机磷农药的相互作用主要体现在传统氢键、碳氢键、疏水作用和Pi-Sulfur键等非键相互作用，抛开范德华力和其他类型的作用力，其中传统氢键和碳氢键对受体蛋白和受体分子之间的结合能贡献较大，而Alkyl键和Pi-Alkyl键等疏水作用次之。从上述例子来看，对接过程受体蛋白结构中催化三联体之一的组氨酸与配体分子至少产生2个以上的相互作用。这对于配体稳定的结合在活性中心非常重要。另外，通过例子可以观察到一些有意思的现象：色氨酸(家蝇：TRP63；桔小实蝇：TRP138、TRP323；三化螟：TRP443)，这些氨基酸的疏水侧链(吲哚基团)为富电子芳香环侧链，丙氨酸(家蝇：PHE407、PHE448；桔小实蝇：PHE382、PHE423、PHE492；斜纹夜蛾：PHE443)，在对接过程中可作为外周阴离子位点、酰基口袋氨基酸或者参与芳香引导机制[14]，这对提高农药分子和受体蛋白的亲和力往往起到正向作用。桔小实蝇和斜纹夜蛾的络氨酸TYR422与TYR442，三化螟和斜纹夜蛾的丙氨酸ALA555和ALA554，都为相同位置氨基酸，与不同农药分子产生相同的作用力，说明这些氨基酸在乙酰胆碱酯酶和农药分子进行互作的过程中功能是保守的，而根据这些氨基酸的性质来看都属于非极性疏水氨基酸，与乙酰胆碱酯酶三维空间结构研究结论中的酰胺骨架和芳香引导机制高度吻合。氢键方面，家蝇的甘氨酸GLY228，三化螟GLY232、GLY234，斜纹夜蛾GLY231、GLY233为同位置氨基酸，对接过程中作为氧阴离子洞组成氨基酸发挥重要作用。而催化三联体组成氨基酸组氨酸，在对接过程中发挥最重要的作用，这个位点氨基酸可能成为在对乙酰胆碱酯酶农药敏感性改进过程中的潜在突变位点。

4 结论

本研究结果表明，通过同源建模的方法来构建晶体结构未知的不同物种乙酰胆碱酯酶的三维结构蛋白的方法可靠。以此为基础进行分子对接研究，结果显示30个物种的乙酰胆碱酯酶和25种有机磷农药分子绝大部分都体现出亲和力，说明在现实情况下这些农药对的有效性。与此同时，三维空间结合模式分析表明，不同物种与有机磷农药分子间的相互作用力来源于氢键和疏水作用居多，作用模式基本符合外周阴离子位点、酰胺骨架、酰基口袋、氧离子洞和芳香引导机制等乙酰胆碱酯酶功能位点假说。另外，通过筛选可从30个物种中挑选与有机磷分子结合最优的物种作为有机磷农药快检的新酶源，这具有现实意义。