冯唐锴 雷 群 罗丽萍 蓝 玉

（1景德镇学院生物与环境工程学院，江西景德镇 333499；2景德镇市第十二小学，江西景德镇 333000）

金银花在抗菌消炎和对抗病毒性疾病方面有一定作用，常用于中药方剂中。绿原酸（Chlorogenic acid，CGA）是金银花重要的药用成分之一，具有多种药用功效[1]。植物绿原酸合成途径有3 条：一是咖啡酰辅酶A 和奎宁酸由羟基化肉桂酸辅酶A或奎宁酸肉桂酸羟基化转移酶催化生成绿原酸；二是在羟基肉桂酰基转移酶等作用下生成p-香豆酰奎宁酸，再由p-香豆酸3-羟化酶（p-coumarate3-hydroxylase，C3H）羟基化生成绿原酸；三是咖啡酰葡萄糖苷作为中间产物，和奎宁酸在羟基化肉桂酰D-葡萄糖、奎宁酸羟基化肉桂酰转移酶催化作用下生成绿原酸。C3H 是绿原酸合成代谢过程中的关键酶，该酶催化咖啡酸的生物合成，这个过程是合成绿原酸的重要步骤。C3H 属于细胞色素P450家族，与各类植物的CYP450 98A 亚家族蛋白具有高度同源性。在植物苯丙素代谢中能催化苯环C3位置的羟基化反应，是绿原酸生物合成的关键酶之一。金银花基因组中有两个C3H拷贝，2013年第一个C3H 基因拷贝（LjC3H）被克隆，亓希武等[2]对另外一个C3H 基因拷贝（LjC3H2）进行了研究。其他植物C3H 也有相关研究，王漫青等[3]的研究表明，当归C3H 基因开放阅读框长1 530 bp，编码509 个氨基酸。周美娟等[4]克隆了慈竹C3H 基因并进行了分析。李高等[5]的研究表明柠条锦鸡儿C3H 与拟南芥C3H 具有部分相同的功能。本文从各类数据库收集了37 种植物40 个C3H 蛋白序列，利用多种生物信息学分析工具，以LjC3H2为研究对象，对该基因表达酶的结构、功能和分类等特点进行了进一步的分析研究。

1 材料与方法

1.1 数据材料

LjC3HL2酶蛋白在NCBI 蛋白质数据库中的序号为ART33341.1。以该蛋白氨基酸序列为样本进行Blast 比对，在NCBI 蛋白质数据库找到37 种植物40个C3H蛋白氨基酸序列，用来对LjC3H2进行分子进化分析。相关植物蛋白序列号如下：金银花（ART33341.1、AGQ48118）、桔梗（AEM63674.1）、夏威夷金合欢（AOX49220.1）、西桦（QGX89943.1）、拧条锦鸡儿（AEV93473.1）、蓟（QQH14908.1）、矮牵牛（AVA30528.1）、毛白杨（AFZ78540.1、APR63682.1）、中粒咖啡（ABB83677.1）、苦荞麦（AHA14499.1）、芝麻（AAL47545.1）、黄水仙（AUG71937.1）、蓝星睡莲（XP_031473498.1）、鲍氏文殊兰（WGU11329.1）、粗壮女贞（WEX29781.1）、红花钓钟柳（WEX29779.1）、沙蓬（WBR79877.1）、茄子（UXQ89629.1）、蓖麻（XP_002511566.3）、圆叶黄山药（XP_039114632.1）、龙葵（QIC52992.1）、缸豆（QCD97092.1）、桃儿七（AIA24412.1） 、水 仙（AGI97941.1） 、 慈 竹（AFD29885.1）、杉木（AFX98060.1）、火炬松（AAL47685.1）、欧洲云杉（CAK22403.1）、地黄（QJS39421.1）、箭叶淫羊藿（AIS92508.1）、陆地棉（ALH21661.1）、南非醉茄（ADM47799.1）、大麻槿（AGA60530.1）、药蜀葵（UOI87846.1）、巨芒草（ANB43566.1、ANB43567.1）、黄芩（BAJ09387.1）和辣椒（ACF17644.1）。这40 个植物C3H 蛋白中，除了沙蓬和欧洲云杉的酶蛋白序列不够完整以外，其他植物的酶蛋白氨基酸数都在510 左右，最少的为503（杉木），最多的为517（西桦、矮牵牛和茄子）。

1.2 生物信息学工具和分析方法

使用的生物信息学工具包括各类在线数据库、在线数据分析网站以及离线分析软件，具体名称、网址及功能如表1所示。

表1 使用的生物信息学分析软件和在线程序

美国国家生物信息中心（NCBI）可用于获得、提交和分析各类生物信息数据。BLAST是其中的一个分析工具，可对不同氨基酸或核酸序列进行同源比较。DNAMAN 是一款高度集成化的序列分析软件，本文利用该软件进行金银花C3H蛋白的辅助序列处理和分析。MEGA 是对物种和种群DNA 和蛋白质序列进行分子进化遗传分析的软件套装，本文利用该软件对不同植物C3H蛋白氨基酸序列进行比较和进化树的构建。ProtParam 是对蛋白质进行理化性质分析的软件，可计算蛋白质的各种物化参数，包括分子量、理论pI 和氨基酸组成等。ProtScale 是对蛋白质进行亲疏水性分析的在线软件。SignalP 6.0能够预测信号肽的存在及其在蛋白质中的切割位点的位置[6]。TMHMM 是对蛋白质进行跨膜螺旋区分析的服务器，用隐马尔可夫模型预测跨膜蛋白拓扑结构[7]。Euk-mPLOC是真核蛋白质亚细胞定位分析工具，包括具有多个亚细胞位点的真核蛋白质也能预测[8]。SOPMA 是一种蛋白质二级结构预测方法，分析蛋白质中α-螺旋、β-折叠和无规卷曲等主要二级结构的存在情况[9]。SWISS-MODEL 得到了Alpha-Fold 蛋白质结构数据库等资源工具的支撑，能高效精准的自动对蛋白质结构进行同源性建模[10]。Prot-Param、ProtScale、SignalP6.0、TMHMM、Euk-mPLOC、SOPMA和SWISS-MODEL这些在线程序都有功能强大，简单易用的特点。对该基因的生物信息学进行分析，将下载好的LjC3H2氨基酸序列导入其输入界面中，再点击提交即可得到相关蛋白信号肽、跨膜结构域、亚细胞定位以及蛋白质二级和三级空间结构的预测分析结果。

2 结果与分析

2.1 LjC3H2编码蛋白的理化性质

通过程序EXPASY 的ProtParam 分析金银花LjC3H2编码蛋白的理化性质。结果显示，LjC3H2编码蛋白质原子总数8 133，分子式为C2601H4083N715O715S19；分子量57 419.53；等电点pI 为8.92；序列的N 末端是M（Met）时估计半衰期为30 h（哺乳动物网织红细胞）＞20 h（酵母）＞10 h（大肠杆菌）。不稳定性指数计算为38.41，即该蛋白质应归类为稳定蛋白质。脂肪指数92.33，亲水性总平均值（重力）-0.231，偏亲水性蛋白。LjC3H2蛋白共含氨基酸残基506 个，包括蛋白质中常见的20 种氨基酸，其中亮氨酸（Leu，11.7%），丙氨酸（Ala，8.3%），精氨酸（Arg，6.9%），缬氨酸（Val，6.9%），脯胺酸（Pro，6.9%），谷氨酸（Glu，6.3%），甘氨酸（Gly，6.1%），赖氨酸（Lys，5.7%），天冬氨酸（Asp，5.1%）含量相对较多，半胱氨酸（Cys，0.8%）最少，带负电荷的残基总数（天冬氨酸+谷氨酸）为58，带正电的残基总数（精氨酸+赖氨酸）为64（表2）。

表2 LjC3H2蛋白质的氨基酸组成

预测LjC3H2在水中280 nm处的消光系数，若假设所有的半胱氨酸残基都形成胱氨酸，则消光系数为80 120，吸光度值（0.1%浓度）为1.395。假设所有的半胱氨酸残基都不形成胱氨酸，则消光系数为79 870，吸光度值（0.1%浓度）为1.391。用DNAMAN软件对LjC3H2做胰蛋白酶的酶切分析，结果表明胰蛋白酶对LjC3H2做酶切分析可得39 个片段。用DNAMNA 软件预测LjC3H2抗原位点的结果表明，在LjC3H2中存在的抗原位点有8个（表3）。

表3 LjC3H2抗原位点预测

用ProtScale 软件对LjC3H2做亲水性和疏水性预测分析，得到的结果如图1 所示。其中以LjC3H2中的氨基酸（aa）序列号作横坐标，亲水性分值作为纵坐标，负值越高表示亲水性越强，正值越高表示疏水性越强。结果表明，除了起始的少数几个氨基酸疏水性较高以外，整个蛋白质没有特别明显的“峰顶”和“谷底”，亲/疏水性相对均匀，整体来看亲水性略高。

图1 LjC3H2亲水性分析

2.2 LjC3H2蛋白的信号肽情况

用DNAMAN 软件对LjC3H2进行信号肽预测分析，结果表明该蛋白自然分裂位点CS 的峰值为0.134 778，在第22 位；OTHER 的峰值为0.999 885，在第70 位；而信号肽峰值为0.262，无明显峰值，即LjC3H2无信号肽。

2.3 LjC3H2蛋白的跨膜结构情况

运用程序工具TMHMM 对LjC3H2蛋白质进行跨膜区分析。结果表明，该蛋白质氨基酸序列长度506，预测出的跨膜螺旋数量为0，跨膜螺旋氨基酸残基数量的期望值为4.674 93，蛋白前60 个氨基酸中，跨膜螺旋的氨基酸量的期望值为4.430 10，位于膜细胞质侧的总概率为0.221 44，预测结果表明LjC3H2没有跨膜结构域。通常蛋白质跨膜螺旋中的氨基酸残基多为疏水性氨基酸残基，亲/疏水性分析结果表明该蛋白偏亲水，这与该蛋白缺乏跨膜螺旋结果是吻合的。

2.4 LjC3H2的基因亚细胞定位

利用Euk-mPLOC对LjC3H2蛋白进行亚细胞定位分析，结果显示LjC3H2蛋白可能在内质网上发挥作用。

2.5 LjC3H2蛋白的二、三级结构

采用SOPMA 对LjC3H2的二级结构进行分析，结果表明，α-螺旋（Alpha helix）占比50.20%；无规则卷曲（Random coil）占比33.00%；β-折叠也称延伸链结构（Extended strand）占比11.66%；β 转角（Beta turn）占比5.14%。表明LjC3H2的二级结构是以α-螺旋为主要类型，无规则卷曲较多，β-折叠即延伸链结构数量较少。在SWISS-MODEL对LjC3H2进行三级结构的比较建模分析，结果表明，LjC3H2与细胞色素P450的三级结构较相似（图2）。

图2 LjC3H2和细胞色素P450建模预测的三级结构比较

2.6 LjC3H2与不同植物间的进化关系

以LjC3H2氨基酸序列为样本进行Blast 比对，获得了37 种植物40 个C3H 蛋白氨基酸序列样本，对这些样本进行同源比较和分子进化分析。结果表明，LjC3H2基因编码蛋白的氨基酸序列与蓟、桔梗的C3H 亲缘关系较近，而金银花另一个C3H 蛋白则与龙葵、粗壮女贞、黄芩、芝麻、红花钓钟柳、地黄以及桃儿七等植物的进化关系较近（图3），这表明金银花中两个C3H 拷贝的分子进化路线可能略有不同。此外，这两个蛋白质在数据库中的命名和作用对象也略有不同，其中LjC3H可能更多作用于香豆酰基酯类，LjC3H2则多作用于香豆酸。

图3 37种植物中的40个C3H蛋白的系统进化情况

3 结论与讨论

LjC3H2作为细胞色素P450 CYP98A 亚家族成员，具有该亚家族蛋白高度相似的空间结构，该蛋白分子偏亲水，没有跨膜结构域，没有信号肽，二级结构以α-螺旋为主，无规则卷曲较多，定位于内质网。分子进化方面，与蓟、桔梗的C3H 亲缘关系较近，与同属于金银花的LjC3H亲缘关系较远。

金银花中有2 个C3H 蛋白的基因拷贝[11-12]，对LjC3H2的研究相对成熟，因此本文选择以LjC3H2作为研究对象，进行深入分析。结果表明，该酶没有跨膜结构域、没有信号肽，位于内质网上，关于该酶的各类分析表明，该酶主要在细胞内起作用。

对多种植物的C3H 进行系统进化分析，结果表明金银花已知的2 种C3H 蛋白在进化上的亲缘关系并不接近，表明这2 个拷贝的基因在进化上可能分属两条不同的路线，有一定的区别。即这2 个基因拷贝表达的酶蛋白在功能上可能存在细微的差异。后续研究可进一步对这2个基因表达的酶蛋白结构进行精细分析和比较，并通过试验方法研究两者的差异。

本文从数据库收集了37 种植物40 个C3H 蛋白序列，利用生物信息学分析工具，以LjC3H2为研究对象，对该基因表达酶的结构、功能和分类等特点进行了分析研究，为今后继续研究金银花C3H 蛋白酶提供参考。