王文娟, 孟骞骞, 李美静,2, 姚祖兵,2, 王宇江, 吴满瑭, 张梦勤, 王文秀

(1.西南大学水产学院,重庆 荣昌 402460; 2.海南大学海洋学院,海南 海口 570228; 3.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东 滨州 256600)

脂类是鱼类重要的营养元素,鱼类体内的脂肪不仅具备基本的供能、贮能作用,还具有提供必需脂肪酸,溶解脂溶性维生素等多种功能[1]。鱼类脂肪摄入不足时,必需脂肪酸、脂溶性维生素也会随之缺乏,从而导致鱼类生长迟缓甚至停滞、抗病力低下及代谢紊乱[2];同时,鱼类将增加对蛋白质饲料的消耗以保证机体能量的供给从而造成蛋白质资源的浪费。因此,适当增加日粮中的脂肪含量,不仅能够满足鱼类对脂类的需要量,节约蛋白质饲料,提高饲料利用率并减少养殖水体中氮的排放,有利于水产养殖业的可持续发展[3]。

然而,高水平脂肪的摄入会增加动物体内脂质的异常沉积、引发机体肥胖、代谢紊乱和炎症,导致生长受到抑制[4]。在对人和小鼠的研究中发现,肥胖往往伴随着血糖的升高。目前关于水产动物糖脂代谢的研究大多集中于探究饲料糖类水平对糖代谢、脂代谢或日粮脂肪水平对脂代谢的影响,关于脂肪水平对鱼类糖代谢影响的报道较少。鱼类属于先天性糖尿病体质,高脂肪饲料的摄入量关乎鱼类的健康和生长。在糖脂比对鱼类影响的试验中发现,随着糖脂比的升高,瓦氏黄颡鱼[5]、暗纹东方鲀(Takifuguobscurus)[6]、建鲤(Cyprinuscarpiovar. jian)[7]、吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus)[8]的肠道淀粉酶活性、血糖水平、血浆胰岛素水平以及肝脏/肝胰脏的糖酵解酶如葡萄糖激酶(GK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)活性及PKmRNA的表达升高,肠道脂肪酶活性及肝脏糖异生酶如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)活性下降。在日粮糖类水平相等(粗纤维除外)的情况下,摄食含5%、10%脂肪日粮的大黄鱼肝脏糖酵解酶如GK、PFK、PK及PEPCK活性因不同的糖源、糖水平呈现出不同的结果。由此推测,日粮脂类可能是一个次于糖类的影响糖代谢的因素,对于鱼类的生长和健康亦非常重要。因此,本研究以鲤(Cyprinuscarpio)为试验动物,通过调节日粮中脂肪含量,结合幼鲤生长性能、形体指标、血清生化指标等探讨日粮脂肪水平对鱼类糖代谢及抗氧化能力的影响,为富含脂肪日粮在鱼类上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

本试验日粮以豆粕和鱼粉为主要蛋白质来源,非转基因大豆油为主要脂肪来源,次粉为主要糖类来源,制备4组不同脂肪水平的饲料,日粮脂肪水平分别为3.68%、7.60%、11.52%及15.44%(表1)。其中,所用氯化胆碱的有效含量为60%。每1 kg预混料提供VA5 100 IU、VD34 800 IU、VE4.8 mg、VK30.30 mg、VB13.00 mg、VB21.80 mg、VB61.20 mg、VB120.03 mg、甲硫氨酸6.00 mg、硫酸铜1.80 mg、硫酸铁12.00 mg、硫酸锰3.60 mg;硫酸锌6.00 mg;碘化钾0.60 mg;轻质碳酸钙0.36 mg。

将豆粕、麸皮等原料粉碎后过60目筛,采用逐级扩大方法混匀,按照配方比例加入豆油和适量水充分混合,用制粒机挤压成直为2 mm的颗粒饲料,在恒温鼓风干燥箱(65 ℃)烘干后,于-20 ℃冰箱中保存备用。风干日粮营养成分含量(表2)为实测值。

表1 风干日粮组成

表2 风干日粮营养成分含量

1.2 试验鱼与饲养管理

试验用鲤幼鱼购买于甘家祠渔场(重庆荣昌,105.6°E,29.4°N),购买的鱼苗经3% NaCl溶液消毒后暂养于西南大学水产学院养殖基地水泥池(2.35 m×1.20 m×0.70 m)中,7 d后挑选规格相近、健康活泼的幼鱼300尾,每尾(17.90±0.16) g随机分为4组,每组3个重复,每个重复25尾鱼,养殖于玻璃水族缸(1.10 m×0.40 m×0.40 m)中。每日定时(8:00,13:00,18:00)投喂,待鱼饱食,清理剩余饵料和粪便。投喂期间观察并记录水温、摄食及生长情况,微流水养殖,24 h持续充氧,每日换水1/3。养殖试验期间,维持养殖水体溶氧量高于6.5 mg/L,水温为25～30 ℃,pH值为7.0～7.7,水体铵态氮浓度低于 0.05 mg/L,养殖周期为58 d。

1.3 样品采集及分析方法

1.3.1 样品采集 养殖试验结束后,禁食24 h,统计每个水族缸中所投喂的饲料质量、幼鲤的尾数,并称取每缸鱼总质量,用于计算生长性能。每个缸中随机挑选3尾鱼,测量体质量和量取体长;采用尾静脉采血方式收集血液于离心管中,静置2 h,以3 000 r/min离心10 min,取血清,保存备测;将鱼放在冰盘上解剖,分离内脏团、肝胰脏以及肠道,分别称质量并测定肠道长度;将肝胰脏样品取出,液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱中,用于测定肝胰脏糖代谢酶活性及抗氧化酶活性;另取5尾鱼剪碎后冻干,保存于-20 ℃冰箱中以测定鱼体成分。

1.3.2 分析方法 参考张丽英的方法[9]对饲料常规营养成分及鱼体成分进行测定,即分别采用105 ℃烘箱干燥法、半微量凯氏定氮法、鲁氏残留法及马弗炉灰化法测定鱼体水分、粗蛋白、粗脂肪及粗灰分含量。

用日立7600-110型全自动生化分析仪测定血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及葡萄糖(GLU)含量。

取肝胰脏组织块约 0.2 g于玻璃匀浆器中,加入9倍体积的0.86%冷生理盐水,在冰浴中充分研磨,制成匀浆液,将匀浆液移入1.5 ml离心管中,3 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液待测。肝胰脏丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)、乳酸(LD)含量、超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及组织蛋白(TP)含量采用南京建成生物公司生产的试剂盒测定;磷酸果糖激酶(PFK)及己糖激酶(HK)活性采用苏州梦犀生物公司生产的试剂盒测定。

1.4 计算公式

1.4.1 生长指标 生长指标包括增重率(WGR)、特定生长率(SGR)、饲料系数(FCR)、成活率(SR)。

WGR=(Wt-W0)/W0×100%

SGR=( lnWt-lnW0)/t×100%

FCR=F/(Wt-W0)

SR=Nt/N0×100%

式中:Wt为终末质量(g);W0为初始质量(g);t为养殖周期(58 d);F为饲料质量(g);Nt为终末每缸鱼总数;N0为初始每缸鱼总数。

1.4.2 形体指标 形体指标包括脏体比(VSI)、肠长系数(ILI)、肥满度(CF)。

VSI=Wv/W×100%

ILI=Lvi/L×100%

CF=W/L3×100%

式中:W为体质量(g);Wv为内脏团质量(g);Lvi为肠长(cm);L为体长(cm)。

1.5 统计分析

用SAS9.4软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA),并使用Duncan’s法进行多重比较,结果以平均值±标准差表示,P<0.05表示显著差异。

2 结 果

2.1 日粮脂肪水平对幼鲤生长及形体指标的影响

日粮脂肪水平对饲料系数(FCR)、增重率(WGR)、特定生长率(SGR)无显著影响(P>0.05)(表3)。随着日粮脂肪水平的升高,饲料系数(FCR)逐渐增加,但差异不显著(P>0.05)。试验期间,各试验组幼鲤成活率(SR)均为100%。本试验条件下,尽管日粮脂肪水平较高的两组幼鲤肥满度(CF)在数值上高于脂肪水平较低的两组幼鲤,但日粮脂肪水平对幼鲤脏体比(VSI)、肠长系数(ILI)及肥满度(CF)无显著影响(P>0.05)。

2.2 日粮脂肪水平对幼鲤鱼体组成的影响

不同日粮脂肪水平对幼鲤粗蛋白含量无显著影响(表4)。幼鲤水分含量随日粮脂肪水平的升高逐渐降低,15.44%日粮脂肪水平幼鲤水分含量(70.29%±1.81%)显著低于其余3组(P<0.05)。幼鲤粗脂肪含量随日粮脂肪水平的升高而持续升高,其中,15.44%日粮脂肪水平幼鲤粗脂肪含量显著高于11.52%日粮脂肪水平,11.52%日粮脂肪水平幼鲤粗脂肪含量显著高于3.68%日粮脂肪水平,15.44%日粮脂肪水平幼鲤粗脂肪含量显著高于其他3个日粮脂肪水平(P<0.05)。3.68%和7.60%日粮脂肪水平幼鲤粗灰分含量显著高于11.52%日粮脂肪水平(P<0.05)。

表3 不同日粮脂肪水平的幼鲤生长指标和形体指标

表4 不同日粮脂肪水平的幼鲤鱼体组成

2.3 日粮脂肪水平对幼鲤血清生化指标的影响

随着日粮脂肪水平的提高,幼鲤血清中葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)含量呈现逐渐升高的趋势,但各日粮脂肪水平幼鲤血清中葡萄糖(GLU)含量差异不显著(P>0.05)(表5)。3.68%日粮脂肪水平幼鲤血清中总胆固醇(TC)含量[(4.41±0.24) mmol/L]显著低于其他3个日粮脂肪水平(P<0.05),11.52%和15.44%日粮脂肪水平的幼鲤血清中的甘油三酯(TG)含量显著高于7.60%日粮脂肪水平(P<0.05)。随着日粮脂肪水平升高,幼鲤血清中高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量表现出升高的趋势,3.68%日粮脂肪水平幼鲤血清中高密度脂蛋白(HDL)[(2.96±0.16) mmol/L]和低密度脂蛋白(LDL)[(4.41±0.24) mmol/L]含量均显著低于其他3个日粮脂肪水平(P<0.05)。其中15.44%日粮脂肪水平的幼鲤血清中高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量均最高,分别为(3.82±0.14) mmol/L和(5.86±0.32) mmol/L。

2.4 日粮脂肪水平对鲤幼鱼肝胰脏糖代谢酶活性的影响

本试验条件下,日粮脂肪水平对幼鲤肝胰脏糖酵解酶活性及乳酸(LD)含量有显著影响(P<0.05)(表6)。7.60%日粮脂肪水平幼鲤肝胰脏己糖激酶(HK)活性最高,显著高于其他3个日粮脂肪水平(P<0.05)。随着日粮脂肪水平升高,幼鲤肝胰脏6-磷酸果糖激酶(PFK)活性升高,3.68%日粮脂肪水平幼鲤肝胰脏6-磷酸果糖激酶(PFK)活性最低,显著低于11.52%和15.44%日粮脂肪水平(P<0.05)。随着日粮脂肪水平升高,幼鲤肝胰脏丙酮酸激酶(PK)及乳酸脱氢酶(LDH)活性呈现出先降低后升高的趋势。7.60%日粮脂肪水平幼鲤肝胰脏丙酮酸激酶(PK)活性最低,15.44%日粮脂肪水平最高,显著高于其他3个日粮脂肪水平(P<0.05)。7.60%和11.52%日粮脂肪水平幼鲤肝胰脏乳酸脱氢酶(LDH)活性均显著低于3.68%日粮脂肪水平,15.44%日粮脂肪水平幼鲤肝胰脏乳酸脱氢酶(LDH)活性显著高于3.68%日粮脂肪水平。3.68%和7.60%日粮脂肪水平幼鲤肝胰脏乳酸(LD)含量显著低于11.52%和15.44%日粮脂肪水平幼鲤(P<0.05)。

表5 不同日粮脂肪水平的幼鲤血清生化指标

表6 不同日粮脂肪水平的幼鲤肝胰脏糖代谢酶活性和乳酸含量

2.5 日粮脂肪水平对鲤幼鱼肝胰脏抗氧化能力的影响

日粮脂肪水平对肝胰脏抗氧化酶活性存在影响(表7)。15.44%日粮脂肪水平幼鲤肝胰脏过氧化氢酶(CAT)活性高于其他3个日粮脂肪水平(P<0.05)。各日粮脂肪水平间幼鲤肝胰脏总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性差异不显著 (P>0.05)。

表7 不同日粮脂肪水平的幼鲤肝胰脏抗氧化酶活性

3 讨 论

3.1 日粮脂肪水平对幼鲤生长性能的影响

脂类在鱼、虾类生命代谢过程中具有多种生理功用,是鱼、虾类所必需的营养物质。日粮中脂肪不足会导致机体代谢紊乱,营养缺乏,饲料利用率下降、生长抑制等[4]。陈云飞[10]指出适当增加饲料中脂肪含量能有效促进草鱼增重率和特定生长率的提高。在点蓝子鱼(Siganusguttatus)[11]、额尔齐斯河银鲫(Carass-iusauratusgibelioBlock)[12]、白甲鱼(Onychostomasimum)[13]、异育银鲫幼鱼(Carassiusauratusgibelio)[14]、吉富罗非鱼[15]的试验中也得到了类似的结果。然而,饲料中过多的脂肪不利于鱼类的生长。李雪菲[16]、许明珠[17]等在美国红鱼(Sciaenopsocellatus)及拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)仔蟹的试验中持续增加饲料中的脂肪水平,动物的WGR和SGR降低。关于黄鳝(MonopterualbusZuiew)[18]、团头鲂(Megalobramaamblycephala)[19]、杂交石斑鱼(Epinephelusfuscoguttatus×Epinepheluspolyphekadion)[20]的研究结果也证实了这一点。本试验中,随着日粮脂肪水平的提高,WGR和SGR下降,FCR上升。然而,付世建等[21]发现南方鲶的生长性能随饲料脂肪水平的升高而升高,这可能与其所设置的脂肪水平未超出南方鲶的需要量有关。

3.2 日粮脂肪水平对幼鲤形体指标和鱼体组成的影响

鱼类的形体指标能够初步反映鱼体的营养状况和健康状况,包括脏体比、肠长系数、肥满度等。当鱼类从饲料中摄入的脂肪较高时,导致脂肪在腹腔、肝胰脏以及肠道等部位积累[22]。本试验中 ,日粮脂肪水平对脏体比、肥满度及肠长系数无显著影响,这与Marins等[23]在比目鱼(HippoglossushippoglossusL.)中的试验结果相同。然而,在军曹鱼(Rachy-centroncanadum)[24]、鳕鱼(Melanogrammusaeglefinus)[25]、吉富罗非鱼[26]的试验中发现,饲料脂肪水平的升高会显著提升鱼体的脏体比和肥满度。造成这些差异的原因可能是不同种鱼类脂肪沉积的部位不同。

鱼体的粗脂肪含量是影响鱼肉品质和营养价值的重要指标,也是决定水产品加工性能的关键因素,研究结果表明,鱼体脂肪含量通常随着饲料脂肪含量的升高而升高[22]。本试验中,随日粮脂肪水平的升高,鱼体脂肪含量显著增加,水分含量持续降低,与点篮子鱼[11]、军曹鱼[24]、梭鱼(Chelonhaematocheilus)[27]、淡水黑鲷(Hephaestusfuliginosus)[28]、春鲤(Cyprinuslongipectoralis)[29]及黑尾近红鲌(Ancherythroculternigrocauda)[30]等的研究结果相似。鉴于形体指标的结果,本试验中,随着日粮脂肪水平的升高,脂肪可能在非内脏部位如肌肉中的沉积增加。高攀等[12]在关于额尔齐斯河银鲫的研究中也发现日粮脂肪水平对脏体比、肝体比及肥满度没有影响,全鱼及肌肉脂肪含量随日粮脂肪水平的升高显著升高。

3.3 日粮脂肪水平对幼鲤血清生化指标的影响

血清生化指标是反映鱼体生理状况的重要指标,受饲料、环境等多种因素的影响。在大菱鲆 (Psettamaxi-ma)[31]、红鳍东方鲀(Takifugurubripes)[32]、团头鲂(Megalobramaamblycephala)[33]、大西洋鲑(Salmosalar)[34]及血鹦鹉(Viejasynspila×Amphilophuscitrinellus)[35]等鱼的血液指标中发现,当所投喂的饲料脂肪含量升高时,对应的试验鱼血清中TC、TG含量会随之升高,本试验亦如此。体内脂质主要是以血浆脂蛋白的形式运输,其中HDL的作用是将肝脏外的胆固醇输入肝脏进行分解,而LDL的作用正好相反,将内源性胆固醇输送到肝外的各个组织[36]。本试验中,血清HDL与LDL含量均随日粮脂肪水平的升高而显著升高,与大口黑鲈(Micropterussalmoides)[37]、梭鱼[38]、额尔齐斯河银鲫[12]的研究结果相似,表明随着日粮脂肪水平的增加,机体脂代谢增强。血糖是机体维持稳态的重要指标之一[39],受饲料成分、应激反应等多种因素的影响,肌糖原和肝糖原对于维持血糖的平稳起到重要作用。马红娜等[40]、陆游等[41]分别以葡萄糖和小麦淀粉作为糖源饲喂大黄鱼,发现在任何糖类水平下,10%日粮脂肪水平与5%日粮脂肪水平的血糖含量差异不显著;在不同糖类水平下,肝糖原和肌糖原含量对日粮脂肪水平的响应不同,例如,当饲料中小麦淀粉或葡萄糖含量为10%和20%时,10%日粮脂肪水平大黄鱼肌糖原含量显著低于5%日粮脂肪水平,当淀粉含量为30%时,10%日粮脂肪水平大黄鱼肌糖原含量又显著高于5%日粮脂肪水平。肝糖原对饲料中葡糖糖水平的响应比淀粉水平更敏感,不同葡萄糖水平,10%日粮脂肪水平大黄鱼肌糖原、肝糖原含量与5%日粮脂肪水平大黄鱼肌糖原、肝糖原含量差异均显著;而日粮中不同小麦淀粉水平,不同脂肪水平间大黄鱼肝糖原含量差异不显著。本试验次粉含量为20%,随着日粮脂肪水平的升高,血糖呈现上升趋势,但差异不显著。因此,如果延长饲喂时间或者增加日粮脂肪水平变化的幅度,超出机体对血糖的调节能力,血糖可能会呈现显著性差异。

3.4 日粮脂肪水平对鲤肝胰脏糖代谢酶活性的影响

糖的无氧酵解及有氧氧化、糖异生、磷酸戊糖途径等是鱼类重要的糖代谢途径。HK、PFK、PK是糖酵解的关键酶。以小麦淀粉为饲料糖源的大黄鱼(Larimichthyscrocea)的试验结果[41]表明,糖酵解酶、糖异生酶活性与脂肪水平无关。而在本试验中,脂肪水平较高时,鲤肝胰脏PFK和PK的活性较高,与翘嘴红鲌(Erythrocu-lterilishaeformis)[42]及以葡萄糖为糖源的大黄鱼的研究结果[40]相似,这说明饲料脂肪水平对糖酵解有影响,其作用受鱼种类以及饲料中脂肪种类、脂肪水平、糖源种类、糖含量等的影响。同时在本试验中发现,日粮脂肪水平最低时,幼鲤肝胰脏PK活性较高,与低脂组草鱼[43]、吉富罗非鱼[44]糖酵解酶基因表达及酶活性显著高于其他组的试验结果一致。由此可以推断对于一些鱼类,能够通过增强糖酵解供能来适应低脂日粮。在王秋梅等[44]关于吉富罗非鱼的研究中发现,脂肪含量较高的两组试验鱼肝脏PFK活性较低,可能与该试验设置的脂肪水平较低有关。

在生物体内,LDH的主要作用在于可逆地催化丙酮酸与LD之间的转化,参与机体的能量代谢调控。LDH是组织损伤判定的重要指标,当鱼类受到低氧胁迫时,组织中LDH活性显著升高[45]。本试验中当日粮脂肪水平为15.44% 时,鲤肝胰脏LDH活性显著高于其他3个日粮脂肪水平,与西伯利亚杂交鲟(AcipenserbaeriiBrandt×A.schrenckiiBrandt)[46]血清LDH活性以及斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)[47]肝脏LDH活性随饲料脂肪水平升高而升高的试验结果相似。这可能与饲喂高脂肪水平日粮导致动物肝脏氧化受损有关[48]。LD是糖无氧酵解产物,同时也是供能代谢的重要底物,当肝胰脏无氧代谢能力增强时,LD累积增加。本试验中,当日粮脂肪水平超过11.52%时,鲤肝胰脏LD含量显著增加,说明高脂日粮会导致组织无氧酵解增强。

3.5 日粮脂肪水平对鲤肝胰脏抗氧化能力的影响

鱼类的抗氧化系统对鱼体的健康和生长起着重要作用。在抗氧化酶系统中,SOD、CAT及GSH-Px是清除自由基的主要抗氧化酶[49-51]。SOD的作用是将机体产生的超氧阴离子自由基还原成过氧化氢(H2O2);CAT则是将机体产生的H2O2转化为H2O和O2;GSH-Px能够将有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物,保护细胞膜的结构和功能不受过氧化物的损害[52]。研究发现,过多的饲料脂肪会导致鱼体内脂质氧化产物增加,进而引起抗氧化酶活性升高,以此维持体内氧化与抗氧化的平衡[53]。本试验中,日粮脂肪水平升高,鲤肝胰脏CAT酶活力升高,表明鱼体处于氧化应激状态,与朱婷婷等[54]对俄罗斯鲟(Acipensergueldenstaedtii)幼鱼的研究结果一致。随着脂肪水平的升高,褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)肝脏[55]、胭脂鱼(Myxocyprinusnsiaticu)肝胰脏[56]抗氧化酶活性呈先增加后降低趋势,前者丙二醛含量持续增加,后者丙二醛含量呈先降后升的趋势。这说明抗氧化功能的发挥与日粮中的油脂种类及其含量有关,日粮中过高的或过低的脂肪含量均不利于机体的抗氧化功能;在低脂日粮中,以鱼油或鱼粉中的油脂为日粮油脂来源的鱼体抗氧化性能优于以豆油为日粮油脂来源的鱼体。

4 结 论

本研究发现,日粮脂肪水平过高会导致幼鲤生长性能下降,影响鱼体组成、血脂含量及糖酵解,造成氧化应激。