邹 杨，符书兰，唐宗祥

（四川农业大学农学院/四川农业大学植物遗传育种省级重点实验室，成都 611130）

条锈病是危害小麦生产的真菌性病害。利用抗病基因是防治小麦条锈病最经济、有效的途径。对已有的条锈病抗性基因进行评价，可为条锈病抗性基因的应用提供参考。对103份携带已知抗性基因的小麦品系进行条锈病抗性鉴定，结果表明仅Yr5、Yr15和Yr45对我国当前流行的生理小种表现全生育期抗性[1]。这些基因为小麦条锈病抗性育种提供了很好的资源。早在2007年就有报道指出，四川的小麦育种者已利用Yr5和Yr15进行小麦条锈病抗性育种，而且对Yr15的利用更多[2]。抗性基因Yr15来自野生二粒小麦[3]，被定位在1B染色体短臂（1BS）远端[4]，并且该基因已被克隆[5]。尽管Yr15对条锈病具有很好的抗性，但就全国范围而言，还没有被大量应用。对107个不同年份审定的山东小麦品种以及2019—2020年参加山东省区试的126 份品系进行了抗条锈病基因的检测，没有发现Yr15的存在[6-7]。在243 份云南普通小麦地方品种中，也没有检测到Yr15的存在[8]。青海的少量小麦品种（系）含有Yr15基因[9]。这些研究表明，Yr15还可以充分加以利用。

在利用抗病基因Yr15进行小麦育种的过程中，从分离世代中快速检测纯合个体有利于加快其应用进程。虽然Yr15有了相应的功能标记[5]，可以被用来准确鉴定植株是否含有该基因，但该标记无法区分纯合与杂合植株[5]。因而在进行选择时，只能混收杂合植株和纯合植株，这会增加后续选择的工作量。另外，利用分子标记进行检测，涉及DNA 提取、PCR和电泳等较为繁琐的过程。为了克服分子标记的缺点，可以探索一种新的途径，既可以起到分子标记的效果，又能快速区分含抗病基因的纯合与杂合个体。基于此，本研究利用Yr15位于1BS上的特点，以含该基因的品系为亲本，与感病的小麦-黑麦1BL.1RS 易位系杂交，然后利用基于寡核苷酸探针的简便ND-FISH技术[10]，对F2分离群体进行鉴定。简便ND-FISH 技术不需提取基因组DNA，也不需要PCR和电泳过程，可以利用根尖或幼嫩叶片快速简便地获得间期细胞核，然后利用特异寡核苷酸探针对间期细胞核进行ND-FISH分析[10]，可以快速排除含1BL.1RS 易位染色体的植株，从而确定含Yr15基因的纯合个体。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为抗条锈病小麦品系F6718和感条锈病小麦-黑麦1BL.1RS 易位系21T248-21。品系F6718 不含1BL.1RS 易位染色体，其系谱为20828-11/13-3Y-2。20828-11高抗条锈病，由中国科学院成都生物所吴瑜研究员提供。13-3Y-2 来自绵阳11与黑麦Kustro 的杂交后代，为1R 单体附加系，高感条锈病。21T248-21为13-3Y-2的辐射后代。普通小麦中国春用作基因检测的对照。

1.2 试验方法

1.2.1 条锈病抗性鉴定

以1BL.1RS 易位系21T248-21 为母本，品系F6718为父本杂交，F1植株套袋自交获得F2群体，种于温江公平镇。用混合条锈菌CYR32、CYR33 和CYR34对亲本、F1和F2植株进行接种鉴定。成株期按照0～9级标准判定条锈病抗感情况[11]。

1.2.2 细胞学鉴定

利用ND-FISH技术对F6718、21T248-21以及F1植株的根尖中期染色体进行细胞学鉴定。根尖中期染色体制备参照Han F.等描述的方法[12]。ND-FISH参照Fu S.等描述的方法[13]。所用探针为OligopSc119.2-1[14]和Oligo-1RNOR[10]。此外，剪取F2单株的根尖或幼嫩叶片，采用简便ND-FISH方法对F2单株进行细胞学分析，各步骤参照张蔚等的方法执行[10]。

1.2.3 分子标记检测

供试材料F6718、21T248-21、20828-11、绵阳11、中国春以及F6718 与21T248-21 杂交后代的基因组DNA 提取参照已报道的改良方法[15]。利用检测Yr15特异的功能标记Y15K1_F2:GGA GAT AGA GCA CAT TAC AGA C; uhw301R:TTT CGC ATC CCA CCC TAC TG 对基因组DNA 进行扩增[5]。PCR程序和琼脂糖电泳参照习玲等报道的方法执行[8]。

2 结果与分析

2.1 亲本F6718、21T248-21 和F1植株细胞学及条锈病抗性鉴定

探针Oligo-pSc119.2-1和Oligo-1RNOR相结合能够识别小麦1B染色体和小麦-黑麦1BL.1RS易位染色体。探针Oligo-1RNOR 能够特异性地在黑麦1RS臂的核仁组织区产生信号[10]。根据这两个探针的信号，可以看出小麦品系F6718 含1 对1B 染色体（图1A），而21T248-21 含1 对1BL.1RS 易位染色体（图1B）。来自F6718×21T248-21的F1植株含1条1B染色体和1条1BL.1RS易位染色体（图1C）。田间条锈病抗性鉴定表明，亲本F6718和杂交F1植株高抗条锈病（图1D），亲本21T248-21高感条锈病（图1D）。

图1 亲本F6718、21T248-21以及杂交F1的根尖中期染色体ND-FISH分析和条锈病抗性鉴定Figure 1 ND-FISH analysis of the root-tip metaphase chromosomes of F6718,F1 plant and 21T248-21,and stripe rust resistance test

2.2 F2代植株细胞学及条锈病抗性鉴定

以Oligo-1RNOR为探针，用简便ND-FISH方法对F6718 和21T248-21 的杂交F2植株进行细胞学鉴定。共鉴定了188 个单株。其中46 个单株没有Oligo-1RNOR 信号，表明这些植株含1 对1B 染色体，不含1BL.1RS 易位染色体（图2A）。106 个单株中都只观察到1个Oligo-1RNOR信号（图2B），表明这些植株含1条1B染色体和1条1BL.1RS易位染色体。在36 个单株中观察到2 个Oligo-1RNOR 信号（图2C），因而这些植株含1对1BL.1RS易位染色体。由此可以看出，利用寡核苷酸探针Oligo-1RNOR和ND-FISH技术对叶片间期核进行分析，能够排除分离群体中含Yr15基因的杂合个体。F2分离群体中，凡是含1对1BL.1RS易位染色体的植株都高感条锈病，其余的都高抗条锈病（图2D，E）。随机选取3株含1对1B染色体植株套袋自交，从每株自交后代中随机选取60 粒种子种于温江，经接种鉴定，都高抗条锈病，没有发现抗感分离的情况。这表明这些植株含纯合的抗病基因。

图2 简便ND-FISH技术分析F2植株的叶片间期细胞及植株条锈病抗性鉴定Figure 2 Simple ND-FISH analysis of interphase cells derived from leaves of F2 plants and stripe rust resistance test

2.3 确定F6718中的抗病基因

根据F2分离群体的染色体组成和抗病情况，可以推测F6718的1B染色体携带条锈病抗性基因，估计该基因为Yr15的可能性较大。因此利用Yr15特异的功能标记对参试材料进行了扩增。在F6718、20828-11、杂交F1植株以及含1B 的F2植株中都扩增出了目标条带，而在21T248-21、绵阳11和含1对1BL.1RS 易位染色体的F2植株中没有扩增出条带（图3）。这一结果表明F6718含有Yr15基因，该基因来源于20828-11。

图3 用特异分子标记检测供试材料中的Yr15基因Figure 3 Detecting the presence of gene Yr15 in the materials used in this study using its specific marker

3 讨论

条锈病抗性基因Yr15对当前流行的条锈菌生理小种仍具有很好的抗性[1]。本研究所用的小麦品系F6718 含Yr15基因，可以用作条锈病抗性育种的亲本。小麦育种过程中，通过有性杂交进行抗病基因的转育仍然是小麦抗病育种的主要途径。为此，尽早在F2分离群体中确定纯合抗病个体可减少后续选择的盲目性，从而减少选择的工作量。分子标记是检测小麦植株是否含有目标基因的常用方法[6-8]。然而，利用分子标记进行筛选时，会出现含有抗性标记目标条带的材料不一定含有相应抗病基因的情况[2,16]。而且，Yr15的功能标记不能鉴别分离群体中的杂合个体和纯合个体。就Yr15基因而言，本研究利用1BL.1RS 易位染色体和简便NDFISH技术，可以快速准确地鉴别分离群体中含Yr15基因的杂合个体和纯合个体，从而针对纯合Yr15个体进行选择。其原理为：F1植株的减数分裂过程中，1B 染色体长臂（1BL）能与1BL.1RS 易位染色体中的1BL臂配对重组，确保F1植株中的1B染色体和1BL.1RS 易位染色体能在减数分裂过程中正常分离。而1BS 和1RS 不会发生重组，这就保证1BS 染色体臂携带的Yr15基因不会被重组掉。继而通过简便ND-FISH 方法，快速准确排除F2群体中含1BL.1RS 易位染色体的植株，确定含1 对1B 染色体的植株，这些植株中Yr15基因处于纯合状态，其条锈病抗性在后续世代中不会出现分离，这就减少了选择的工作量。就1BL.1RS 易位染色体而言，尽管目前已有分子标记能对其进行鉴定，而且也能区分植株含1条还是1对1BL.1RS易位染色体[17]。然而，以上所述基于分子标记的方法都涉及基因组DNA提取、PCR 和电泳过程，略显繁琐。本研究基于寡核苷酸探针的简便ND-FISH 方法，不需要基因组DNA 的提取、PCR 和电泳过程，能快速鉴定植株中的目标染色体，其方便快捷的特点已发文详述[10]。当从不同杂交组合的F2群体中鉴定出纯合抗病个体后，它们还可以作为亲本相互杂交，一方面增加了遗传多样性，同时也保证了目标基因在杂交后代中也处于纯合状态。

这一方法也可以用于其他染色体携带的抗病基因。目前已创制了不少小麦-黑麦易位染色体[18]，都可以加以利用。比如，为了利用位于2B 染色体长臂上的条锈病抗性基因Yr5，可以用感病的小麦2B 染色体长臂（2BL）与黑麦染色体形成的易位系为亲本，与含Yr5的抗病材料杂交，用同样的原理和方法从F2分离群体中排除含小麦-黑麦易位染色体的植株，保留不含小麦-黑麦易位染色体的植株，就获得了含Yr5基因的纯合个体。为此，在今后的小麦-黑麦远缘杂交后代的鉴定中，可以保留不抗病的小麦-黑麦易位系。这些易位系不但可以帮助验证抗病基因染色体定位的正确性，还可以从F2分离群体中快速筛选纯合抗病个体。事实上，就鉴定含Yr15基因的纯合个体而言，只要明确了某一材料含有Yr15基因，用作亲本的1BL.1RS易位系也可以是抗病的，因为这不影响判断植株是否含有1 对1B 染色体，因而也不影响判断植株是否含1对Yr15基因。用其他小麦-黑麦易位染色体选择相应染色体携带的抗病基因也是如此。然而，该方法的缺陷在于：为了增加小麦背景的遗传多样性，需要事先将小麦-黑麦易位染色体转移到不同的小麦背景。

4 结论

利用小麦-黑麦1BL.1RS 易位系，借助基于寡核苷酸探针的简便ND-FISH 技术，可以快速准确地从F2分离群体中鉴定出含Yr15的纯合抗病个体。此方法也适用于其他抗病基因的纯合个体的筛选。