蒋 云，张连全，郝 明，范超兰，甯顺腙，姜 博，杨苗苗，张 洁，吕季娟，刘登才*

（1.四川省农业科学院生物技术核技术研究所，成都 610061；2.四川农业大学小麦研究所，成都 611130；3.四川省种子站，成都 610041）

小麦胚乳中含有的贮藏蛋白赋予了小麦面团弹性和延伸性，因而极大地丰富了小麦加工终产品的多样性。谷蛋白是小麦贮藏蛋白的主要组成部分之一，根据十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），可将谷蛋白分为高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）和低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）。其中，编码小麦HMW-GS 的基因位于小麦染色体1A、1B 和1D 长臂的Glu-1的位点上，分别被称为Glu-1A、Glu-1B和Glu-1D位点。每个位点由2个紧密连锁的基因组成，分别编码一个分子量较大的x型亚基和一个分子量较小的y型亚基。大量研究证实，HMW-GS 的组成和数量对谷蛋白聚合体的数量和质量有重要作用，与小麦面团加工品质关系密切[1-2]。

研究表明，Glu-1D对加工品质的影响效应大于Glu-1A和Glu-1B。Glu-1D的等位基因中最重要的是5+10 和2+12[3]，虽然针对5+10 和2+12 品质效应的评价较多，但大多数研究以分离群体、自然群体或姊妹系为材料，遗传背景的差异影响了结果准确性。而近等基因系排除了遗传背景对加工品质的干扰，能够更加准确地评价单个HMW-GS亚基或亚基组合对面团品质参数和终端产品品质的影响。利用HMW-GS 近等基因系，国内外学者对5+10 和2+12 的品质效应开展了一系列研究。上述研究表明，大多数情况下5+10 和2+12 亚基对籽粒蛋白质含量[4-16]、Zel 沉降值[10-13]及面团形成时间[7,10-11]的影响不明显，5+10 对谷蛋白大聚体的合成[4-6,17]、面团稳定时间[8-7,14-15,18]、拉伸面积[10-11,14-15]、最大拉伸阻力[7,10-11,14-16]及面包评分[7,10-14]有正向影响，对终端产品品质的研究主要集中于面包烘焙品质，馒头、面条研究比较缺乏[19-20]，而饺子、饼干未见相关报道。

目前，四川优质小麦品种缺乏，发掘优良育种基因仍是四川小麦品质育种的重要基础工作[21-22]。但目前尚不清楚在四川寡日照、多阴雨等特殊生态条件下，5+10 和2+12 亚基在小麦品质育种上的利用价值。本研究创制了HMW-GS 近等基因系蜀麦1764A 和蜀麦1764B，其Glu-A1和Glu-B1位点亚基类型为1和20，Glu-D1位点分别为5+10和2+12，代表了四川省绝大多数小麦品种（系）Glu-D1位点的类型[3]。进一步，评价了二者在四川省多点试验和区域试验中的综合农艺性状、产量、品质参数和终产品品质，为四川寡日照生态条件下小麦加工品质改良提供了参考。

1 材料和方法

1.1 研究材料

新品系蜀麦1764 来自杂交组合Syn-SAU-43/030080//N07-361/3/川麦42（图1），其中Syn-SAU-43 为人工合成六倍体小麦，其他为四川小麦品种（系）。Syn-SAU-43 来自于栽培二粒小麦PI113961与节节麦AS2404 远缘杂种的染色体自动加倍[23]。中国春（chinese spring，CS）用作高分子量谷蛋白亚基分析的对照材料。

图1 蜀麦1764选育过程Figure 1 Breeding process of Shumai 1764

1.2 研究方法

1.2.1 SDS-PAGE检测

利用SDS-PAGE 在蜀麦1764（F7代）的混收种子中检测HMW-GS 剩余变异。SDS-PAGE 检测参考郑柯等[24]的方法。

1.2.2 SNP芯片检测

55K SNP 芯片检测委托中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司进行，数据处理参考Hao M.等[25]的方法，用Microsoft Excel 365 和Python 3.9 软件进行数据处理，用R 3.0.4软件作图。

1.2.3 农艺及品质性状调查

2018—2019年度，近等基因系蜀麦1764A 和1764B 在四川省5 个试验点进行多点品比试验（绵阳、郫都区、广汉、内江、射洪）；2019—2020年度，二者参加了四川省小麦区域试验，共8 个试点（绵阳、新都、内江、射洪、南充、广元、双流、乐山），2年共13点次。各试点的试验设计、田间管理和调查规范按照四川省区域试验要求进行。随机区组设计，3次重复，小区面积13.34 m2。调查的农艺性状包括产量、全生育期、单株分蘖数、单株有效穗、株高、有效穗、千粒重、穗粒数和粒质。单株分蘖数=最高苗/基本苗，单株有效穗=有效穗/基本苗。

品质性状测试，从各个试点的3 次重复中取等量籽粒，分别形成蜀麦1764A和蜀麦1764B的混样，委托农业农村部谷物及制品质量监督检验测试中心（哈尔滨）进行测试。测试指标及测试方法，包括容重（GB/T 5498-2013）、出粉率（NY/T1094.1-2006）、粗蛋白（干基）（NY/T 3-1982）、降落数值（GB/T 10361-2008）、湿面筋（14% 水分）（GB/T 5506.2-2008）、沉淀指数（GB/T 2119-2007）、粉质仪指标（吸水量、面团形成时间、面团稳定时间、弱化度、粉质质量指数、评价值GB/T14614-2019）、拉伸仪指标（最大拉伸阻力、延伸性、能量、R/E比值 GB/T14615-2019）、硬度（GB/T 21304-2007）、面包（GB/T14611-2008）、饺子（LS/T3203-1993）、面条（GB/T17320-2013）、馒头（GB/T17320-2013）、酥性饼干（LS/T3206-1993）总评分及分项评分。计算蜀麦1764A高于或低于1764B的百分比。

数据处理和统计分析用Microsoft Excel 365 和DPS 7.55完成。

2 结果与分析

2.1 近等基因系创制与鉴定

2016年秋播前，随机选取蜀麦1764 的F7代种子，通过SDS-PAGE 进行HMW-GS 检测，发现由3 种HMW-GS 亚基组成，分别为A 型（1、20、5+10）、B 型（1、20、2+12）和H 型，H 型为A 型和B 型的杂合（1、20、2+12/5+10）。在分析的384 粒种子中，筛选出杂合种子共3粒，杂合种子的频率为0.86%。3种类型的单株收获后，分别随机检测90 粒种子，发现A、B两种类型的HMW-GS组成不分离。但是，H型仍能分离出A 型、B 型和H 型（图2），将分离出的A 型和B 型植株分别扩繁成系，命名为蜀麦1764A（含5+10亚基）和蜀麦1764B（含2+12亚基）。

图2 蜀麦1764 Glu-D1位点杂合型单株后代HMW-GS分离情况Figure 2 HMW-GS isolation from a heterozygous single plant at Glu-D1 locus of Shumai 1764

SNP 数据用于近等基因系蜀麦1764A 和蜀麦1764B的遗传背景分析。结果表明，99.82%（37878/37947）的标记在蜀麦1764A和1764B间的分型结果一致，说明二者遗传背景高度一致。分型结果不一致的69 个位点中，有58 个位点集中于1D 染色体403-414 MB 区间（图3），表明二者的差异主要在该区间。根据中国春参考基因组序列IWGSC_Ref-Seq_v1注释，Glu-1D位点位于1D染色体412-413 MB之间。由此从遗传上证明了蜀麦1764A 和蜀麦1764B为Glu-1D位点有差异的近等基因系。

图3 蜀麦1764A和1764B基因组差异对比Figure 3 The genomic differences between Shumai 1764A and 1764B

农艺性状和产量方面。2018—2019年度的多点品比试验和2019—2020年度的四川省区域试验中，二者在所有农艺性状及产量上无显著差异（图4，表1）。这表明，源自1D 染色体的403～414 MB 区间差异，对农艺性状和产量影响小。从四川省小麦区域试验资料可知，近等基因系蜀麦1764A和蜀麦1764B综合性状表现优良，比区域试验对照品种绵麦367分别增产2.2%和1.9%，千粒重分别增加了15.5%和17.5%，有效穗分别增加了26.2%和7.4%，但穗粒数比对照分别降低了13.1%和16.6%，二者均属穗数型品系。

表1 蜀麦1764A和1764B 2年多点农艺性状统计分析Table 1 Statistical analysis of the agronomic traits of Shumai 1764A and B in two-year multi-point experiment

图4 蜀麦1764A(左)和蜀麦1764B(右)单株Figure 4 Single plants of Shumai 1764A (left) and Shumai 1764B (right)

2.2 品质性状分析

农业农村部谷物及制品质量监督检验测试中心（哈尔滨）测试结果表明，有的参数在年度之间变动很大，有的参数年度间表现一致稳定（表2）。相比蜀麦1764B，蜀麦1764A 2年均表现较高的品质参数有容重、出粉率、稳定时间、粉质质量指数、最大拉伸阻力（Rm,135）、能量、R/E比值(拉伸比)和硬度。其中，有5个参数的差异十分明显，差异大小依次为：①R/E比值(拉伸比)，蜀麦1764A 比1764B 两年平均高139.3%；② 最大拉伸阻力（Rm,135），蜀麦1764A 比1764B 高123.0%；③ 面团稳定时间，蜀麦1764A 比1764B 长103.5%；④ 能量，蜀麦1764A 比1764B 高97.88%；⑤ 粉质质量指数，蜀麦1764A 比1764B 长45.9%。连续2年蜀麦1764A均比蜀麦1764B降低的参数有粗蛋白、吸水量、弱化度和延伸性（E,135）。其中，弱化度的降低最大，其次为延伸性。

表2 蜀麦1764A和1764B 2年试验品质参数比较Table 2 Comparison of quality parameters between Shumai 1764A and B in two-years

终产品品质上，2年资料均表明蜀麦1764A 比蜀麦1764B 有更高的面包总评分和馒头总评分，但面条总评分较低（表3）。饺子和饼干总评分在年度间高低不一致。进一步分析单项评分发现，对于面包，蜀麦1764A的面包体积2年均比蜀麦1764B高，而其余单项年度间高低不一致。对于馒头，比容、高度、表面色泽、表面结构、表面形状、芯结构和黏性的2年平均数均是1764A 更高，而重量和体积则是1764B更高，弹性、韧性和口感二者一致。对于面条，1764B 的色泽、黏弹性比1764A 更出色，而表观状态、硬度则1764A 较高，光滑性和食味二者均表现一致。

表3 蜀麦1764A和1764B加工产品评分Table 3 Total and itemized score of end-use products of Shumai 1764A and B

3 讨论

HMW-GS近等基因系的培育方法上，目前报道的多是回交法获得[12-15]。该方法通过轮回亲本和供体亲本杂交、回交，后代通过分子标记或SDS-PAGE检测，从而创制基于轮回亲本遗传背景的HMW-GS近等基因系。该方法创制的近等基因系，其综合农艺性状类似于轮回亲本。本研究则利用高世代株系的剩余杂合体筛选创制HMW-GS近等基因系，从F7代品系中筛查剩余杂合变异，获得了HMW-GS近等基因系蜀麦1764A 和1764B。这2 个系主要的遗传差异在于包含HMW-GS 位点的1D 染色体403～414 MB 区间。2年田间农艺性状分析未发现二者有显著差异，因此尽可能地排除了遗传背景对品质分析带来的影响。对于易受环境和遗传背景影响的复杂性状和数量性状，这样的近等基因系是遗传研究的理想材料[26-28]。在作物遗传育种实践中，可以通过筛查剩余杂合体的方法创制不同的近等基因系，将特色品种选育和遗传研究紧密结合起来。

由于欧美小麦的终产品以面包为主，因此西方学者对HMW-GS 的评价主要是针对面包的烘烤品质，并据此提出了HMW-GS 的优质亚基和劣质亚基[8-10]。大多数报道认为5+10亚基的面包加工品质优于2+12[8-11,14-18]，但也有少数研究发现某些遗传背景下二者差异不显著[14-17,19]或2+12 更优[18]。本研究发现亚基5+10 的面包体积和总评分均大于2+12，和国内外多数学者研究结果一致。本研究表明5+10 亚基在四川“阴雨多、寡日照”特殊气候条件下，仍然对面包加工品质有促进作用。从具体参数看，HMW-GS 对面团品质的差异主要体现在面筋强度上。与2+12相比，5+10亚基的R/E比值(拉伸比)、最大拉伸阻力（Rm，135）分别增加了139.3%、123.0%（表2），表明具有5+10亚基的面团弹性好、韧性大、筋力强，发酵时面团膨胀会受阻，面团更坚硬不易形变。这与面团稳定时间表现一致，5+10亚基的稳定时间较2+12 延长约1 倍，说明面团稳定性好，反映5+10对剪切力降解有较强的抵抗力，也就意味着其麦谷蛋白的二硫键更牢固，面粉筋力越强。能量方面，5+10 比2+12 亚基高约1 倍，表示拉伸过程中所做的功越多，面筋筋力越强。有研究表明，5亚基比2 亚基多一个半胱氨酸，可增加面团中二硫键数量，对蛋白质2级结构影响显著，能增强亚基间交联度，有利于谷蛋白大聚合体（glutenin macropolymer，GMP)聚合以形成更为致密的面筋网络，从而改善了面团品质[29]。

我国传统蒸煮食品的加工品质与蛋白质含量和质量、淀粉品质和磨粉品质等均有关联[30]。在我国传统食品加工品质上，对HMW-GS的优劣评价不能简单借用面包标准，须专门研究HMW-GS对中国传统小麦食品品质的影响，为专用型小麦品种的选育和应用提供依据。金慧等[21]研究表明，5+10/2+12亚基的差异仅体现在馒头表面色泽上；邓志英等[31]认为，馒头品质对HMW-GS 的类型要求不严格，主要受单个HMW-GS表达量的影响。本研究发现5+10比2+12亚基的馒头评分有少量增加。但对于面条，本研究发现2+12 亚基组合的评分高于5+10 组合。方正武等[32]研究发现5+10 亚基显著提高了面条质构参数中的硬度，但一些背景下5+10亚基会使面条偏硬，其效果不如2+12 亚基。在四川盆地，面条小麦可优先考虑2+12 亚基组合。具体到品质参数，2年间2+12 比5+10 的延伸性(E，135)更大，说明在发酵过程中面团的面筋网络形成状态好、不易破裂。前人认为5+10亚基与2+12亚基对延伸性和拉伸阻力的影响存在负相关[33-34]，在本研究中2+12 的延伸性更好，而5+10 的拉伸阻力更大，印证了前人的结果。本研究发现饺子和饼干总评分在年度间高低不一致，无法评估5+10和2+12亚基对这2种加工产品的影响。

4 结论

在小麦高代育种群体中筛选剩余杂合体，创制了HMW-GS 的5+10/2+12 近等基因系。在四川生态条件下，5+10/2+12 亚基对小麦籽粒蛋白质含量没有显著影响，但是前者提高了面筋强度、降低了延伸性。对于面包、馒头品质，5+10 亚基优于2+12亚基，但对于面条品质，2+12 亚基优于5+10 亚基。5+10/2+12 亚基可能不影响饺子和饼干的加工品质。