周芷伊 赵 莉 王衡新 蒋飞荣 舒长宏 邓姣梅 潘任桃 邓友田

1.天地恒一制药股份有限公司，湖南长沙 410331；2.湖南安生美药物研究院有限公司，湖南长沙 410000

活络消痛胶囊是由刺五加浸膏、威灵仙、当归、制川乌、制草乌等10 味药材组成的传统中药制剂，具有通经活络、舒筋止痛的功效。用于风寒湿痹，经络闭塞，筋骨疼痛，四肢麻木。据文献报道，活络消痛胶囊治疗膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）具有较好的临床疗效[1-3]，此外，还可用于治疗颈椎病[4]及糖尿病周围神经病变等慢性疾病[5]。

KOA 具有发病率高、病程长、阶梯性明显、对生活质量影响大等特点[6-9]。活络消痛胶囊治疗此类疾病需长期反复用药，但其安全性数据暂无报道，无法确认长期用药对身体造成的影响，大多中成药目前仍存在安全性信息尚不明确的问题，这在一定程度上影响了其疗效与安全性[10-11]。为初步探讨其临床用药安全性，本研究开展活络消痛胶囊单次给药和6 个月重复给药毒性试验研究，判断药物的蓄积毒性反应、剂量毒性效应关系、毒性靶器官及可逆性，推测重复用药的安全剂量范围，提示临床试验中需重点监测的指标，以便为临床长期用药提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

ME1002E 型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]、DF50Vet 型动物用五分类血液细胞分析仪（深圳市帝迈生物技术有限公司）、BS-430 型全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）、K-Lite6B 型电解质分析仪（梅州康立高科技有限公司）、C3100 型全自动凝血分析仪（北京普利生仪器有限公司）、URIT-150Vet 型动物尿液分析仪（桂林优利特医疗电子有限公司）、ECLIPSECi-L 型尼康生物正置显微镜（NIKON）、ImageViewDS-1600 型成像系统（杭州图谱光电科技有限公司）

1.2 药品与试剂

活络消痛胶囊（天地恒一制药股份有限公司，批号：201401），临床拟用剂量：一次4 粒，一日3 次，0.35 g/粒，4.20 g 内容物/d，每0.35 g 胶囊内容物相当于0.66 g 生药，成人日服生药量为7.92 g 生药/d。

异氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批号：1902801）、血细胞分析用溶血剂LYF-1（深圳市帝迈生物技术有限公司，批号：2021022201）、血细胞分析用稀释液（深圳市帝迈生物技术有限公司，批号：2021090401）、血细胞分析仪用质控物（深圳市帝迈生物技术有限公司，批号：BC1121）、质控血清（RANDOX，批号：1396UN）、电解质测定试剂（梅州康立高科技有限公司，批号：DE21060001）、电解质质控品（梅州康立高科技有限公司，批号：L21020001）、UQ 尿质控液（桂林优利特医疗电子有限公司，批号：55210100）。

1.3 实验动物

SD 大鼠40 只，SPF 级，雌雄各半，体质量181.50 ～207.40 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证号：No.430727211100809045，伦理审查编号：IACUC-2021CY2016ATS2；SD 大鼠160 只，SPF 级，体重：180.20 ～219.90 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证号：No.430727211100865621，伦理审查编号：IACUC-2021CY2017CTS2。二者生产许可证编号：SCXK（湘）2019-0004，使用许可证号：SYXK（湘）2018-0004。购入后检疫适应环境5 ～6 d，对动物外观健康、临床症状等情况观察，各项指标达到试验要求，经湖南安生美药物研究院有限公司实验动物管理（伦理）委员会审查、批准后实施。

1.4 方法

1.4.1 急性毒性试验 采用最大给药量法，选用SD 大鼠，40 只，雌雄各半，体重181.50 ～207.40 g，按体重性别区段随机分为空白对照组、活络消痛胶囊组，每组各20 只。受试物最大浓度为0.40 g 内容物/ml，最大给药量30.20 g 生药/kg，相当于人临床拟用剂量267 倍。受试物与去离子水按20 ml/kg分别经口灌胃，实验前禁食不禁水12 h 以上，给药当日给药2 次（两次给药间隔约6 h，两次给药间禁食不禁水）。给药当天密切观察并记录各组大鼠的中毒表现和特点、毒性反应出现及恢复时间以及死亡情况等，然后每天观察2 次（上、下午各1 次），连续观察14 d 动物临床症状。分别于给药当日给药前及给药后第4、7、10、14 天对大鼠体重进行称量，第15 天解剖大鼠，进行大体观察。

1.4.2 长期毒性试验 选用检疫合格的SD 大鼠160 只，体重180.20 ～219.90 g，雌雄各半，按体重采用区段随机分为空白对照组及活络消痛胶囊低、中、高剂量组，每组各40 只。本品临床拟用剂量为4.20 g 内容物/ d，成人按平均体重70 kg 计。活络消痛胶囊高、中、低三个剂量组（11.30、5.70、2.80 g 生药/kg）分别约相当于人日服用剂量的100、50、25 倍，同时设空白对照组（去离子水），给药体积均为15 ml/kg，每天1 次，每周7 d，连续26 周，恢复期停药观察4 周。给药3 个月、停药4 周按计划各组分别解剖10 只大鼠，雌雄各半。给药6 个月，按计划各组分别解剖20 只大鼠，雌雄各半。检查项目包括：一般临床观察；体重、摄食量测定；眼科检查；尿液检查；血液学、血液生化、电解质、凝血及脏器系数测定；组织病理学检查。

1.5 统计学分析

采用SPSS 16.0 统计学软件进行数据分析，量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较满足正态性和方差齐性时采用t检验，数据不满足正态性时采用Mann-Whitney Test，系统解剖及组织病理学采用定性指标判断结果。P＜ 0.05 为差异有统计学意义，P＜ 0.01 为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠急性毒性试验结果

给药后连续观察14 d，空白对照组和活络消痛胶囊组大鼠自主活动、精神状态和饮食情况均未见明显异常，未见相关毒性反应及动物死亡，大体解剖肉眼观察各器官均未见明显异常情况。给药后14 d 内称重，活络消痛胶囊组与同期空白对照组动物体重比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05），见表1。

表1 急性毒性试验中大鼠体重变化情况比较（g，）

表1 急性毒性试验中大鼠体重变化情况比较（g，）

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2.2 长期毒性试验

2.2.1 活络消痛胶囊对一般状况的影响 给药期和恢复期观察期间，活络消痛胶囊各剂量组与同期空白对照组比较，动物的外观体征、行为活动及动物的一般状况等未出现与药物毒性相关的异常。

2.2.2 活络消痛胶囊对体重的影响 试验期间活络消痛胶囊各剂量组与同期空白对照组比较，高剂量组雄性大鼠的体重明显下降，差异有统计学意义（P＜ 0.05），但经4 周停药观察期可恢复。见表2。

表2 长期毒性试验中大鼠体重变化情况比较（g，）

表2 长期毒性试验中大鼠体重变化情况比较（g，）

注 与空白对照组比较，aP ＜ 0.05，aaP ＜ 0.01

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2.2.3 活络消痛胶囊对尿液指标的影响 活络消痛胶囊给药6 个月，与空白对照组比较中剂量组隐血赋值及高剂量组尿比重差异有统计学意义（P＜ 0.05），但无明显的量效关系，见表3。

表3 长期毒性试验中活络消痛胶囊对大鼠尿液指标的影响（）

表3 长期毒性试验中活络消痛胶囊对大鼠尿液指标的影响（）

注 与空白对照组比较，aaP ＜ 0.01；“-”为阴性

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2.2.4 活络消痛胶囊对血常规、生化指标、电解质、凝血指标的影响 活络消痛胶囊各剂量组血常规指标血小板计数、网织红细胞计数、嗜碱性细胞比例与同期空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05），但无明显的剂量、时间关系。生化指标丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、三酰甘油（triglycerides，TG）、γ-谷氨酰基转移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）、葡萄糖（glucose，GLU）等与同期空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05 或P＜ 0.01），但无明显量效关系。电解质钠、钾、氯与同期空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。凝血指标中活化部分凝血活酶时间和血浆凝血酶时间与同期空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05），但无明显的剂量、时间关系，见表4 ～6。

表4 长期毒性试验中活络消痛胶囊对大鼠血常规的影响（）

注 与空白对照组比较，aP ＜ 0.05

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表5 长期毒性试验中活络消痛胶囊对大鼠血液生化指标的影响（）

注 与空白对照组比较，aP ＜ 0.05，aaP ＜ 0.01；ALT-天门冬氨酸氨基转移酶；AST：丙氨酸氨基转移酶；ALP：碱性磷酸酶；GGT-γ：谷氨酰基转移酶；BUN：尿素氮；GLU：葡萄糖；TG：三酰甘油；TBIL：总胆红素

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表6 长期毒性试验中活络消痛胶囊对大鼠对电解质及凝血指标的影响（）

表6 长期毒性试验中活络消痛胶囊对大鼠对电解质及凝血指标的影响（）

注 与空白对照组比较，aP ＜ 0.05

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2.2.5 活络消痛胶囊对眼科及脏器系数的影响 试验期间活络消痛胶囊各剂量组及空白对照组眼科检查未见明显异常。与同期空白对照组比较，中、高剂量组部分脏器系数差异有统计学意义（P＜ 0.05或P＜ 0.01），雌性动物给药6 个月中、高剂量组及雄性动物高剂量组给药3 个月、给药6 个月肝脏脏器系数异常显示与时间、剂量有一定相关性，但停药4 周恢复正常，见表7。

表7 长期毒性试验中活络消痛胶囊对大鼠尿脏器系数的影响（）

表7 长期毒性试验中活络消痛胶囊对大鼠尿脏器系数的影响（）

注 与空白对照组比较，aP ＜ 0.05，aaP ＜ 0.01

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2.2.6 大体解剖和病理检查 大体观察给药3 个月、给药6 个月和停药4 周各组解剖的动物脏器颜色、大小、质地均未见明显病理改变；显微镜下观察发现肝脏、心脏及肾上腺等脏器可见组织病理学改变，但活络消痛胶囊高剂量组与空白对照组比较，病变类型及病变动物数量、病变程度差异无统计学意义（P＞ 0.05），见图1。

图1 HLXT 对SD 大鼠肝脏组织病理学图像示例（HE 染色，×200）

3 讨论

活络消痛胶囊为已上市多年中药复方制剂，临床多用于骨关节炎、颈椎病等慢性疾病[1-5]，需长期反复用药，由当归、制川乌、制草乌等10 味药材组成，制川乌、制草乌均为有毒药材，毒性靶器官主要是心血管系统和神经系统[12-15]。为保证用药安全，本研究按照《药物单次给药毒性研究技术指导原则》[16]《药物重复给药毒性研究技术指导原则》[17]对活络消痛胶囊的毒性进行评价，阐明药物的毒性作用、了解其毒性靶器官及重复接受药物后的毒性特征，为上市后药品提供安全性评价依据。

急性毒性试验结果显示，大鼠以最大给药量经口灌服活络消痛胶囊，给药累积剂量为30.20 g 生药/kg（临床给药剂量的267 倍），动物未见相关毒性反应及死亡，表明活络消痛胶囊无急性毒性。长期给药毒性试验中，最大给药剂量11.30 g 生药/kg（临床给药剂量的100 倍），给药6 个月，动物的外观体征、行为活动及一般状况等均良好无异常。与对照组比较，活络消痛胶囊高剂量组雄性动物体重明显下降，差异有统计学意义（P＜ 0.05），但经停药4 周可恢复，综合其他各检测指标分析，造成因素可能是给予高浓度药液，造成摄食量减少所致。活络消痛胶囊组与同期空白对照组比较对部分血常规、生化指标、电解质、凝血指标及尿液指标差异有统计学意义（P＜ 0.05），但无明显的剂量、时间关系，故认为该变化无毒理学意义。与同期空白对照组比较，活络消痛胶囊雌性动物给药6 个月中、高剂量组及雄性动物高剂量组给药3个月、给药6 个月肝脏脏器系数异常，差异有统计学意义（P＜ 0.05），且显示与时间剂量有一定相关性，但停药4 周恢复正常，结合解剖时大体观察、病理检查和血液生化检查结果分析，未见明显异常，故认为该差异无毒理学意义。大体解剖观察结果和病理检查各组别动物脏器均未见明显异常，未发现活络消痛胶囊对SD 大鼠有明显的毒性作用。

综上所述，活络消痛胶囊无急性毒性及长期毒性，药物的最大耐受量（maximal tolerance dose，MTD）≥30.2 g 生药/kg，相当于人日服用剂量的267 倍；未观察到临床不良反应的剂量水平（no observed adverse effect level，NOAEL）为11.3 g 生药/kg，相当于人日服用剂量的100 倍，在治疗剂量范围内用药安全性高，长期重复服用无蓄积毒性，安全性风险低。