袁相凤 罗增香 李建娜 孙丽娜

潍坊医学院附属医院皮肤科，山东潍坊 261013

白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤病，发病率占全球人口的0.5%～2.0%[1]。该疾病的特征是黑色素细胞丢失，导致皮肤出现典型的非杯状白色斑点。近年来，研究者对白癜风发病机制的认识取得了较大进展，目前已明确将白癜风归类为自身免疫性疾病。白癜风不仅影响患者容貌外观，而且会给患者心理上造成沉重的压力，在日常生活导致诸多不便[2]。黑素皮质受体（melanocortin receptors，MCRs）参与了包括色素沉积、摄食、能量代谢、抗感染等各环节的调节。目前已经发现了5 个MCRs家族成员：MC1R ～MC5R，其中黑素皮质受体1（melanocortin 1 receptor，MC1R）蛋白参与黑色素的生物学反应，影响黑色素细胞的产生。MC1R 活性降低会导致头发变红、肤色变浅。另有研究指出，MC1R 活性降低与雀斑、皮肤癌的发生也有关[3-5]。研究发现在白癜风患者皮肤组织中MC1R 基因表达下调，提示MC1R 可能是与白癜风相关的基因[6]。目前MC1R 在白癜风黑色素细胞中调控作用的相关研究报道罕见。因此，本研究探讨MCIR 在白癜风黑色素细胞中的作用和机制，旨在阐明白癜风发生机制，为临床诊治靶点选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

正常人表皮黑色素细胞系PIG1 和白癜风黑色素细胞系PIG3V 购自上海中科院。Trizol 试剂盒和细胞转染试剂盒（美国Invitrogen 公司），Western Blot 一抗（美国ABCam 公司），Western Blot 酶标二抗和活性氧（reactive oxygen species，ROS）试剂盒（南京建成生物研究所），真核表达载体和siRNA（上海吉玛公司），MTT 试剂盒（德国Thermo 公司），凋亡试剂盒（美国BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 MC1R 真核表达载体和siRNA 转染细胞 PIG1细胞用于构建MC1R 敲减细胞模型，随机分为MC1R siRNA 组、siRNA 阴性对照（negative control，NC）组和空白对照（PIG1）组；PIG3V 细胞用于构建MC1R过表达细胞模型，随机分为过表达（overexpression，oe）-MC1R 组、MC1R NC 组和空白对照（PIG3V）组。将5 μl MC1R siRNA/siRNA NC、pcDNA-MC1R/pcDNA NC 与245 μl Opti-MEMTM减血清培养基混匀；将5 μl 转染液和245 μl Opti-MEM 混匀；再将以上两种混合液混合，室温放置30 min；缓慢将上述混合液逐滴滴加到相应组别的6 孔板孔中，混匀，37℃培养6 h，更换成完全培养液继续培养24 h。

1.2.2 Western Blot RIPA 蛋白裂解液提取细胞总蛋白，定量检测蛋白浓度后，电泳分离，转膜后封闭，含5%脱脂奶粉的1×TBST 缓冲液按1 ∶100稀释一抗，4℃过夜。用1×TBST 缓冲液洗膜后，加入二抗，室温下孵育60 min，用1×TBST 缓冲液洗膜3 次。ECL 试剂显色，并成像。

1.2.3 MTT 检测 将各组细胞消化后计数，调整浓度为105/ml，按100 μl/孔加入96 孔板，每组设3 个复孔，共接种6 块96 孔板，放回培养箱继续培养。在接种后的第0、6、12、24、48、72 小时，分别取出1 块96孔板，向各孔加入10 μl MTT 检测试剂，将96 孔板放回培养箱培养4 h，用酶标仪检测OD450，以时间为横坐标，绘制反映细胞生长情况的增殖曲线。

1.2.4 流式细胞术检测周期和凋亡 将各组细胞消化后计数，调整为105/ml 的细胞悬液。向流式细胞管中先加入20 μl 膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰基荧光素（FITC），再加入100 μl 各组细胞，混匀后室温遮光孵育15 min，再各加入20 μl 碘化丙啶（propidine iodide，PI），混匀后室温避光孵育10 min。设置仅加20 μl Annexin V-FITC 或仅加20 μl PI 的两支单阳管和不加任何试剂的阴性对照管。各管加入1 ml PBS 缓冲液，混匀，上机检测。

1.2.5 活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测 将各组细胞用胰蛋白酶消化后计数，铺6 孔板培养过夜。向6 孔板各孔加入1 ml 不完全DMEM 培养液按1 ∶1000 稀释的2，7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针，继续培养60 min。将细胞置于荧光显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学处理

使用GraphPad Prism 8.0.2 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用SNK-q 检验，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 调控MC1R表达对黑色素细胞增殖的影响

MC1R siRNA 组细胞MC1R mRNA 和蛋白表达降低（P＜ 0.05），显著抑制细胞增殖（P＜ 0.05）；oe-MC1R 组细胞MC1R mRNA 和蛋白表达增高（P＜ 0.05），促进细胞增殖（P＜ 0.05）。见图1。

图1 调控MC1R 表达对黑色素细胞增殖的影响

2.2 调控MC1R表达对黑色素细胞周期和凋亡的影响

MC1R siRNA 组下调MC1R 表达后导致黑色素细胞凋亡率增加（P＜ 0.05），G2/M 期细胞所占比例升高（P＜ 0.05）；oe-MC1R 组细胞过表达MC1R 后抑制黑色素细胞凋亡，G2/M 期细胞所占比例降低（P＜ 0.05）。见图2。

图2 调控MC1R 表达对黑色素细胞周期和凋亡的影响

2.3 调控MC1R表达对黑色素细胞ROS产生的影响

MC1R siRNA 组细胞下调MC1R 表达后ROS水平显著增加（P＜ 0.05），oe-MC1R 组细胞过表达MC1R 后ROS 水平显著降低（P＜ 0.05）。见图3。

图3 调控MC1R 表达对黑色素细胞ROS 产生的影响

2.4 调控MC1R表达对黑色素细胞促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase phosphatases，MAPK）通路、凋亡和细胞周期相关蛋白表达影响

MC1R siRNA 组细胞下调MC1R 表达后Bcl-2、Cyclin D1 蛋白水平降低（P＜ 0.05），p-p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、Caspase 3、Bax、p53 和p21 蛋白水平升高（P＜ 0.05）。oe-MC1R组细胞过表达MC1R 后Bcl-2、Cyclin D1 蛋白水平升高（P＜ 0.05），p-p38 MAPK、JNK、Caspase 3、Bax、p53 和p21 蛋白水平降低（P＜ 0.05）。见图4。

图4 调控MC1R 表达对黑色素细胞MAPK 通路、凋亡和细胞周期相关蛋白表达影响

3 讨论

MC1R 是黑色素生成和色素沉着的调节剂之一。研究表明，白癜风患者非病变皮肤中MC1R 的表达减少，而上调MC1R 表达可能通过负反馈机制恢复病变皮肤中的正常色素沉着[7-8]。但是否可以通过调控MC1R 表达从而改变黑色素细胞生物学行为尚未见报道。本研究通过人为干预细胞中的MC1R 表达水平，使人正常黑色素细胞低表达MC1R，而白癜风黑色素细胞高表达MC1R，从而进一步观察各组细胞生物行为变化，并对相关机制进行初步研究。

本研究结果显示，MC1R siRNA 组MC1R 表达减少后，黑色素细胞增殖速度明显减慢，而转入过表达载体的oe-MC1R 组，MC1R 表达显著增加可以加速白癜风黑色素细胞的增殖速度，该结果提示过表达MC1R 对黑色素细胞的增殖有促进作用。既往研究提示在白癜风病变过程中，由于黑色素细胞数量减少，导致患者病情加重，而在其病变组织中MC1R 表达水平明显降低，MC1R 表达降低可抑制黑色素细胞增殖，病变组织不能及时补充黑色素细胞，因此无法代偿患者的病变损伤[9]。本研究表明可以通过上调MC1R 的表达，促进黑色素细胞增殖，有利于白癜风病变组织补充黑色素细胞，从而辅助白癜风治疗。

白癜风病变组织中黑色素细胞数量减少除了和增殖减慢无法代偿病损之外，同时也和黑色素细胞破坏增多密切相关，研究证实G2/M 期阻滞能诱导黑色素细胞凋亡，进而导致黑色素细胞破坏增多，加重了黑色素细胞减少[10-11]。本研究发现，在黑色素细胞中敲减MC1R 的表达，可以导致黑色素细胞凋亡率增高，G2/M 期细胞所占比例升高；而在白癜风黑色素细胞中上调MC1R 表达，可降低白癜风黑色素细胞的凋亡率，G2/M 期所占比例降低，结果证实MC1R 表达下调能引起黑色素细胞的G2/M期阻滞，促进黑色素细胞凋亡，这可能是导致白癜风病情进展的重要因素之一。

既往研究表明[12-16]，病理情况下，ROS 过度累积可以直接或间接损伤DNA、蛋白质、脂质等生物大分子，诱导细胞启动凋亡程序，引起皮肤黑色素细胞破坏和丢失，是白癜风发病的重要机制之一。本研究显示，在黑色素细胞中敲减MC1R 的表达，导致ROS 水平升高；反之，在白癜风黑色素细胞上调MC1R 表达，可引起ROS 水平降低，该结果提示高表达MC1R 能减轻白癜风黑色素细胞中ROS 损伤发生，促进黑色素细胞中的氧化-抗氧化系统平衡，保护细胞不受氧化应激损伤。

MAPK 通路是真核细胞中一个经典的信号通路，可以参与细胞凋亡和细胞周期过程。MAPK 通路中p-p38 MAPK 能促进p53 磷酸化，磷酸化抗凋亡蛋白Bcl-2 家族相关成员，促进线粒体细胞色素释放，激活Caspase 级联反应，激活凋亡蛋白Caspase 3，从而诱导细胞凋亡。细胞受损时，p53 能激活p21 转录，使细胞周期停滞在G2 期，对于无法完成修复的细胞，将诱导启动凋亡程序，细胞周期蛋白Cyclin D1 能促进细胞周期进展[17-20]。本研究进一步发现，敲减MC1R 在正常人黑色素细胞的表达，Bcl-2、Cyclin D1 蛋白水平降低，p-p38 MAPK、JNK、Caspase 3、Bax、p53 和p21 蛋白水平升高。而上调MC1R 在癜风黑色素细胞表达，则逆转上述蛋白表达水平。

本研究结果证实了高表达MC1R 能够调控MAPK 途径以及抑制ROS 产生，进而调控细胞凋亡蛋白家族和细胞周期相关因子，从而抑制黑色素细胞凋亡，上调G2/M 期，促进细胞增殖。本研究在既往研究基础上进一步深入研究，探讨了MC1R在黑色素细胞增殖和凋亡中的作用和相关调控机制，并证实了MC1R 可以作为白癜风黑色素细胞中的关键调控因子。但本研究存在一定局限性，目前仅停留在细胞水平上，未在动物水平进一步证实，在下一步研究中拟建立白癜风动物模型，分析调控MC1R 表达对白癜风的治疗作用和相关机制，从而为临床白癜风新靶点确定提供参考。

综上所述，MC1R 可能通过调控MAPK 途径和ROS 生成，调控细胞周期和凋亡相关因子，引起黑色素细胞生物学行为改变，参与白癜风黑色素细胞的病变过程。