梁秋亭 谢衬梨 王惠嫦 柳元斌 陈立冲 袁炜良

广东省东莞市滨海湾中心医院呼吸与危重症医学科，广东东莞 523900

铜绿假单胞菌是气道常见致病菌，在人体免疫失衡时，会突破免疫屏障，从局部侵入并大量繁殖，导致气道炎症，破坏气管壁及周围肌肉组织，引起支气管、毛细支气管管腔扩张[1]。随着病情进展，支气管扩张症患者将面临呼吸困难，甚至肺功能衰竭等严重并发症[2]。有学者建议将感染性支气管扩张症的治疗靶点放在“抗免疫失衡”上[3]。严锡祥等[4]将胸腺肽α1 用于治疗重症肺部感染性疾病，取得显著疗效，证明胸腺肽α1 具备免疫调节作用，该药可改善患者的免疫失衡问题。但回顾近年研究文献，未见胸腺肽α1 应用于感染性支气管扩张症方面的研究。本研究通过一项动物实验，探讨胸腺肽α1 对铜绿假单胞菌感染支气管扩张症大鼠免疫调节的影响，论证胸腺肽α1 治疗支气管扩张症的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

将2022 年10 月至2023 年2 月采购于广州艾舒娜生物科技有限公司的50 只铜绿假单胞菌介导的Balb/c 大鼠纳入研究，动物许可证号：SYXK（粤）2022-0293。随机抽取其中10 只大鼠，处死后剥离气管、支气管、肺脏，依照常规进行组织病理学检查；随后取20 只大鼠应用胸腺肽α1 皮下注射治疗，为观察组，雄雌比例1 ∶1，3 ～6 周龄，平均（4.78±1.12）周，体重20 ～27 g，平均（24.02±2.49）g；另20 只大鼠应用生理盐水皮下注射，为对照组，雄雌比例1 ∶1，3 ～6 周龄，平均（4.73±1.10）周，体重19 ～26 g，平均（23.78±2.13）g。所有大鼠的操作及饲养符合东莞市滨海湾中心医院实验动物伦理委员会规定。

本研究使用LightScanner 32 Real Time PCR 逆转录-聚合酶链反应仪（美国Idaho 公司）及其配套试剂；FlexiWash FW400 自动化蛋白免疫印迹杂交系统（cellagen technology）及其配套试剂；Attune 流式细胞仪（赛默飞世尔科技公司）及其配套试剂；BK-EL10C酶标仪（山东博科医用材料有限公司）及其配套试剂。

1.2 方法

1.2.1 铜绿假单胞菌感染支气管扩张大鼠的模型建立方法 取仰卧位固定大鼠，常规消毒后麻醉，在距唇下3 cm 的颈部做一纵切口，长度约1 cm，纵向分离气管。于环状软骨下较宽的气管软骨间隙做一横切口，长度约2 cm，备气管插管。自制气管插管，缓伸至胸骨角下约3 cm 处，有抵触感即达右侧肺底叶。使用微量进样器经插管快速注入0.02 ml（1012 CFU/ml）菌液和1 ml 气体后，拨管并竖起固定板，让大鼠呈垂直体位，避免大鼠术后呼吸障碍。待大鼠呼吸平稳，纵向缝合气管切口，横向两层缝合颈部肌群与皮肤。

1.2.2 药物干预 观察组大鼠，腹腔皮下注射胸腺肽α1（Patheon ltalia S.P.A.公司，国药准字H20171177，规格：1.6 mg/支）0.5μg/kg，q12h×3 d，对照组大鼠皮下注射生理盐水（同等容积注射）。

1.2.3 样本采集 于建模后第28 天处死全部存活大鼠36 只（其中对照组4 只大鼠分别于建模后第19、20、22、26 天死亡，确定死亡后即刻采集样本），收集支气管肺泡灌洗液与鼠尾外周血作为观察样本。经钝头静脉采血针，于气管朝肺泡灌入1.5 ml无菌PBS 缓冲液，收集1 ml 支气管肺泡灌洗液并离心；大鼠尾巴处抽取外周血2 ml，离心后置于-80℃环境冷藏待检。

1.2.4 病理实验 大鼠处死后剥离气管、支气管、肺脏，依照常规进行组织病理学检查。以戊二醛用石蜡包埋、固定肺组织，切片，苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，随后观察组织学改变情况。依照病理实验判定大鼠建模成功。

1.3 观察指标

通过逆转录-聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）方法测定线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）含量，免疫蛋白印迹试验检测Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR）9 表达，流式细胞术测定支气管肺泡灌洗液及外周血白细胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）4+细胞计数、CD8+细胞计数、辅助性T 细胞（helper T cell，Th）17 细胞计数、调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）细胞计数，采用酶联免疫吸附试验检测支气管肺泡灌洗液及外周血白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-6、IL-10、IL-17 的表达水平。

1.4 统计学处理

使用SPSS 21.0 统计学软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（）表示，采用t检验，计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理结果

观察组层次清晰，上皮细胞和纤毛整齐排列，无渗出物，管腔内外无炎性细胞浸润，腔内偶见分泌物，肺泡组织清晰，肺泡壁未见增厚，无异常增生与浸润。

为进一步判定大鼠建模成功，再观察对照组大鼠的组织学情况，见大鼠支气管管壁有不同程度破坏，伴有局部溃疡，管腔扩张明显，同级支气管腔内有局部炎性细胞和滤泡增生。部分支气管在血管内，可见充血、出血情况，血管周围有炎性浸润，肺泡腔和肺间质中有大量炎性细胞浸润，病变区域大鼠肺泡结构受损，肺泡壁变薄，有断裂融合为大疱的情况，一些肺泡腔伴有不同程度的出血，说明实验大鼠建模成功。见图1。

图1 肺组织病理（HE 染色）结果

2.2 两组mtDNA、TLR9水平比较

观察组mtDNA 水平高于对照组，TLR9 水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表1。

表1 两组mtDNA、TLR9水平比较（）

表1 两组mtDNA、TLR9水平比较（）

注 MtDNA：线粒体DNA；TLR9：Toll 样受体9

?

2.3 两组CD4+、CD8+细胞计数比较

观察组CD4+细胞计数、CD8+细胞计数高于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表2。

表2 两组CD4+、CD8+细胞计数比较（个/mm2，）

表2 两组CD4+、CD8+细胞计数比较（个/mm2，）

注 CD：外周血白细胞分化抗原

?

2.4 两组Th17、Treg水平比较

观察组Th17 水平高于对照组，Treg 水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表3。

表3 两组Th17、Treg水平比较（%，）

表3 两组Th17、Treg水平比较（%，）

注 Th17：辅助性T 细胞17；Treg：调节性T 细胞

?

2.5 两组IL-2、IL-6、IL-10、IL-17水平比较

观察组IL-2、IL-6、IL-17 水平低于对照组，IL-10水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表4。

表4 两组IL-2、IL-6、IL-10、IL-17水平比较（ng/L，）

表4 两组IL-2、IL-6、IL-10、IL-17水平比较（ng/L，）

注 IL：白细胞介素

?

3 讨论

支气管扩张症与支气管炎有本质上的区别，首先，前者病情基本为慢性进展，后者急性发病情况并不少见；其次，前者为不可逆性的支气管壁结构性病变，而后者为可逆性病变[5]。支气管扩张症病因众多，其中以感染最为常见[6]。Chandrasekaran等[7]研究显示，感染铜绿假单胞菌是发病的主要因素。患者若治疗不当，易引发呼吸障碍、肺源性心脏病等严重不良预后。近年来该病的发病率有所增加，针对该病的治疗研究，应予重视[8]。

mtDNA 是线粒体基因组，有与细菌DNA 相似的结构末甲基化鸟嘌呤岛，其作为一种缺乏保护性内含子、组蛋白与染色质结构的裸DNA 分子，具有高突变性[9]。研究表明[10]，mtDNA 能够激活机体先天免疫与炎症反应，并参与炎症过程，故mtDNA成为一些炎症疾病的治疗新靶点。目前已知的哺乳动物TLR 有13 种，该物质主要在树突细胞、内皮细胞、上皮细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等免疫效应细胞中表达，在调节获得性/固有免疫反应上具备显著作用[11]。目前已知TLR3 以外的所有TLR 种类，均可启动MyD88 依赖途径，刺激核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），诱导炎症因子过量表达[12]。TLR9 位于细胞内膜，可与致病菌中尚未甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（motifs oligodeoxynucleotides，CpG DNA）特异性结合，激活信号转导通路和中下游分子，此时机体内一些炎症因子会过量释放，这是TLR9 参与人体炎症反应的机制[13]。若TLR9 特异性地识别mtDNA 中未甲基化的CpG 岛，会引发瀑布链式炎症反应。治疗细菌感染所致的支气管扩张症，治疗靶点为mtDNA与TLR9。改善上述生理指标的表达水平，或许有助于改善患者的炎症反应。本研究结果显示，观察组大鼠接受胸腺肽α1 皮下注射治疗，其mtDNA水平、TLR9 水平有所改善（相较于对照组而言），本研究表明：①mtDNA、TLR9 参与大鼠支气管扩张症病情进展；②胸腺肽α1 治疗支气管扩张症的药用机制或许为调节mtDNA、TLR9 水平。Treg细胞参与免疫应答过程，Th17 细胞参与炎症反应。Th17 细胞分泌IL-17，为T 辅助细胞，促炎；而Treg 细胞分泌IL-10，是免疫调节淋巴细胞，与促炎因子相互制约，与Th17 相抗衡[14]。保障机体良好的内环境，改善炎症情况，需维持好Treg 细胞与Th17 细胞之间的平衡。本研究结果显示，观察组Th17 水平高于对照组，Treg 水平低于对照组，表明观察组大鼠的免疫耐受维持情况更佳，组织间的动态平衡更加理想。观察组IL-2、IL-6 水平低于对照组，表明观察组大鼠的机体炎症反应得到进一步改善。

究其原因是观察组大鼠注射了胸腺肽α1，该药物为28 个氨基酸构成的短肽（酸性多肽），为典型的免疫调节剂，在癌症人群中应用较多，近年来一些学者以该药纠正患者的免疫功能，改善患者的免疫失衡问题。在规范用药下，机体细胞免疫功能会进一步增强。药物主要是通过影响T 细胞亚群含量，从而发挥免疫“增效”作用。吕建宁等[15]研究强调，CD4+细胞计数、CD8+细胞计数与淋巴细胞免疫功能的调整之间存在影响，前者参与细胞免疫，后者参与体液免疫；临床一般通过检测CD4+、CD8+细胞计数水平，评估患者是否出现免疫障碍。谭颖[16]研究发现，经过胸腺肽α1 治疗，支气管扩张患者的CD4+、CD8+细胞计数水平较给药前显著提升，这与本研究中“观察组大鼠CD4+细胞计数、CD8+细胞计数高于对照组”的结果一致，证实胸腺肽α1能够改善病鼠的免疫失衡问题。吕建宁等[15]强调，胸腺肽α1 治疗支气管扩张症，药效机制还可能与抗氧化、阻断病灶氯离子通道、下调内皮素-1 水平等因素有关，药物能够改善气道收缩功能，使气管舒张，有助于缓解患者的呼吸困难问题。

综上所述，mtDNA、TLR9 参与铜绿假单胞菌感染支气管扩张症大鼠的发病过程，疾病进展与机体免疫失衡、炎症进展有关。胸腺肽α1 治疗铜绿假单胞菌感染支气管扩张症，通过干预上述发病机制，提高大鼠机体免疫力，改善炎症反应，应用价值高。本研究存在一些局限性，主要在于研究时间不长、大鼠的观察样本量不足，这可能会在一定程度上导致本研究结论欠客观。因此未来需要进一步延长研究时间、扩大样本量，以提高研究的客观性。