桂志明 黄健 李世豪 吴昊开 汪前亮

广东医科大学附属医院泌尿外科，湛江 524001

膀胱癌作为泌尿系最常见的恶性肿瘤，位居全球恶性肿瘤发病率第9 位及病死率第13 位［1］，其极易复发并伴随着较差的预后，使临床治疗困难。目前，针对膀胱癌尚无较好的药物治疗策略，仍以手术切除为主，但浅表性膀胱癌电切术后复发率高达50%～70%，其中10%～20%患者可进一步发展为浸润性膀胱癌［2］。但传统意义上的放化疗则往往治疗效果不佳，不论是针对膀胱癌细胞的肿瘤杀伤指数偏低，或是治疗不良反应偏大，使这种治疗手段无法在临床获益［3］。基于这一现状，研究新的治疗策略，开发新的治疗药物，提高临床治疗效果，已极为迫切。目前，临床上药物治疗膀胱癌除了丝裂霉素C 及表柔比星等化疗药物外，还有一些较好的治疗药物。研究发现，卡介苗可通过刺激患者免疫进而抑制肿瘤进展，是非肌层浸润性膀胱癌最有效的治疗方法，此外，部分中药及腺相关病毒也在近年来展现出足够的治疗潜力，有望为膀胱癌的治疗提供助力［4］。尤其是中药，在近年来，逐渐在肿瘤治疗领域展露光彩，但因缺乏系统性的研究框架，未能深入揭示中药治疗肿瘤的功能机制。较单靶点药物而言，传统中药（TCM）具有多成分、多靶点、多途径协同作用的强大优势［5］。此外，与化学合成的药物相比，TCM 以其天然产物的身份往往更易于人体吸收，且在很大程度上对机体是无害的，这极大弥补了其他治疗药物不良反应大的巨大缺陷［6］。丹参作为著名药材应用于临床治疗中，尤其在心脑血管方面具备悠久的使用历史，疗效显著［7］。随着研究深入，丹参在癌症治疗中的作用日益凸显，大量文献对此进行了报道［8-10］，但并未系统阐明丹参在膀胱癌治疗中的作用机制。随着生物大数据的精确性不断提高以及生物信息学、系统生物学与药理学的不断融合，基于网络药理学揭示中药有效成分及精准靶点的Network 模式已被认为是一种极具潜力的研究方法［11-15］。本研究基于这一方法，深入分析丹参的有效活性成分及其潜在分子靶点，结合膀胱癌患者的癌症基因图谱（TCGA）数据集，进行预后及风险回归分析等，确定其治疗靶点，并在体外细胞中进行实验研究，为丹参治疗膀胱癌提供详细的分子机制基础，为临床应用提供实验依据。

材料与方法

1.材料

膀胱癌细胞系：5637、T24、J82、UMUC3（ATCC 细胞库）；正常膀胱上皮细胞：SV-HUC-1（ATCC 细胞库）。抗体：脂肪酸合成酶（FASN）（Proteintech；10624-2-AP）。丹参提取物：扶风斯诺特生物科技有限公司购买。培养液：1640培养基（GIBCO）；DMEN 基础培养基（GIBCO）；MEM 培养基（GIBCO）；FBS（胎牛血清，依客赛）；L-Glutamine 200mM（100X）（GIBCO）。耗材：培养皿（耐思NEST），Transwell 小室（REF，353097）。研究时间：2022 年1 月至2023年6月。

2.方法

2.1.网络药理学筛选丹参有效成分及分子靶点 基于中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）获得丹参的成分信息，根据生物利用度（OB）≥30%，类药性指数（DL）≥0.18 的标准筛选有效药物成分，通过Swiss Target Prediction 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）收集有效成分的治疗靶点并在Cytoscape软件中进行可视化分析。

2.2.基因本体论（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能富集分析 通过WebGestalt 数据库（https：//www.webgestalt.org/）对这些分子靶点进行GO 与KEGG 功能分析，并对前十位的通路进行可视化。

2.3.TCGA膀胱癌数据集筛选 从TCGA数据集（https：//tcga-data.nci.nih.GOv/tcga/）下载截至2023年7月11日前膀胱癌患者的RNA-seq测序数据及临床资料，包括生存状态等临床信息，纳入上述获得的药物分子靶点进行预后分析（P＜0.05），筛选存在预后价值的丹参-疾病基因，同时应用“limma”包分析这些基因在癌与癌旁组织中的差异表达（P＜0.05）。

2.4.风险回归模型构建 本研究纳入TCGA 数据集共408 个膀胱癌样本，随机分为训练集和测试集，各204 个。训练集用于构建丹参-疾病基因的风险回归模型，测试集用于验证所建立的模型。基于先前获得的44 个具有预后价值的靶点，使用R 软件包“glmnet”进行lasso-Cox 回归分析。进而从TCGA 数据集中筛选出18 个与肌层浸润性膀胱癌（MIBC）患者的总生存率显著相关的丹参-疾病基因，基于这些基因成功建立风险模型。使用以下公式计算风险评分：风险评分=coe（fRNA1）×expr（RNA1）+coe（fRNA2）×expr（RNA2）+……+coe（fRNA18）×expr（RNA18），coef 表示与存活相关的RNA 系数，expr（RNA）表示RNA 的表达。根据中位风险评分建立包括低风险组和高风险组的亚组。

2.5.关键蛋白FASN 验证 在获得风险基因后，进一步结合其风险系数，基因表达水平与预后信息进行筛选，确定FASN 是最显著高风险基因后，在常见膀胱癌细胞系中进行Western blot 蛋白检测：细胞培养至80%时停止生长，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗后加入RIPA裂解液进行细胞蛋白提取。以7.5%的SDS-PAGE 分离胶进行电泳，转膜后加入标记FASN 和GAPDH 抗体在4 ℃冰箱孵育过夜，TBST 清洗聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后再加入对应的二抗（Rabbit）室温下孵育1 h，TBST清洗后借助ECL显影液进行显影。

2.6. 细胞分组和处理 取生长至对数期的J82 细胞，待细胞生长至70%时进行处理，分别加入丹参提取物（1 mg/ml）与PBS（阴性对照）进行处理。

2.7.细胞增殖、侵袭及迁移能力检测 细胞增殖：取生长状态好的细胞进行铺板（96 孔板），然后加入丹参提取物处理，分别在24 h、48 h、72 h 进行MTT 检测细胞增殖情况；侵袭：首先将细胞在六孔板中进行铺板，待细胞生长至70%时进行药物处理，待细胞长至90%时进行细胞划痕实验，观察细胞横向迁移能力变化；侵袭：同样取正常细胞，在细胞长至70%进行药物处理，待细胞长满后用胰酶消化，提前在Transwell 小室内部进行基质胶处理，然后在小室内加入5×103个药物处理过的细胞与正常细胞，待24 h后取出小室以棉球擦除小室内部未穿过的细胞，以结晶紫染色拍照，观察细胞侵袭能力变化。

3.统计学方法

研究结果采用SPSS 16.0 软件统计分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行组间比较。

结果

1.构建丹参-有效成分-靶点网络

将丹参有效成分及其靶点信息输入Cytoscape_v3.8.2进行可视化分析，得到药物-有效成分-靶点的网络图，其中丹参有效成分65个，靶点270个（图1）。

2.丹参靶点的功能富集分析

在获得丹参靶点信息后，进行GO 与KEGG 功能富集分析，结果显示其主要富集在氮代谢、膀胱癌、内分泌抵抗、催乳素信号通路、前列腺癌及其他癌症等通路上，展现出丹参在膀胱癌及其他癌症中的治疗潜力（图2）。

图2 丹参有效靶点的GO功能富集分析（A）及KEGG功能富集分析（B）

3.膀胱癌有效靶点预测

将270个药物靶点输入膀胱癌TCGA 数据集中（Tumor：408 比Normal：19），结合患者预后信息进行筛选，其中44 个基因在膀胱癌中具有预后价值（P＜0.05），接着基于“limma”R 包分析其在膀胱癌与癌旁之间的表达水平，结果显示，其中33个基因存在差异表达（图3）。

图3 44个基因预后信息（A）及44个基因在膀胱癌与癌旁中的表达水平（B）

4.基于18个基因构建风险回归模型

研究基于其中的18 个基因在膀胱癌测序数据集中建立风险回归模型，其测试集（204 例）曲线下面积（AUC）=0.819，验证集（204 例）AUC=0.661，具备预测价值（图4）。MAOA、NR1H3、PTPN6、PDE10A、CASP9、POLB及EED是低风险基因，而MMP9、HCAR2、ADRA2C、PSMB5、SUZ12、FASN、MAP2K1、PGR、SLC6A2、HTR2B、ABCC9 则是高风险基因，研究结合患者临床信息发现，高风险基因在TNM 高等级患者中表达水平更高（图5）。研究进一步分析这些基因在癌与癌旁间的表达，结果显示，MAOA 作为低风险基因在癌中显著低表达，而HCAR2、FASN、MMP9及PSMB5则作为高风险基因在癌中显著高表达，其中又以FASN系数最高（图6）。预后信息同样显示其预后较差。总生存率：HR=1.66，无复发生存期：HR=2.61，可作为促癌基因进行后续研究分析（图7）。

图4 基因构建风险回归模型。A：10倍交叉验证的LASSO回归图谱；B：18个基因的LASSO系数图谱；Kaplan-Meier对高风险和低风险人群中MIBC的生存分析（C：测试集：D：验证集）；风险评分模型ROC（E：测试集：F：验证集）

图6 风险基因在癌与癌旁中的表达水平分析

5.丹参可抑制FASN 表达进而抑制膀胱癌细胞增殖侵袭及迁移能力

在常见膀胱癌细胞系及正常膀胱上皮细胞中检测发现，FASN 在J82 细胞系中显著高表达，而丹参提取物在10 mg/L 时不影响膀胱上皮细胞生长但可显著抑制膀胱癌细胞生长，并可抑制其增殖、侵袭及迁移能力（图8）。

讨论

随着我国对中医药发展创新的日益重视，探索中药在多种疾病尤其是肿瘤领域中的治疗效用是重要方向，而科学的研究理念结合先进技术手段可以更深入挖掘其间机制。丹参不仅可作为心脑血管治疗药物，其在肿瘤治疗中同样具备显著治疗作用。Zhou 等［16］研究发现，丹参酮Ⅰ可通过使磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/蛋氨酸合成酶通路失活，进而诱导细胞凋亡和自噬并最终减弱卵巢癌的恶性生物学特性；Chen 等［17］研究显示，丹参多糖可通过激活Toll样受体介导的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核转录因子-κB信号通路进而激活癌症患者的T细胞免疫，缓解肿瘤患者免疫微环境抑制状态。Cao等［18］研究同样显示，丹参提取物-二氢丹参酮能通过调节胱天蛋白酶与细胞色素C 进而诱导神经胶质瘤细胞的凋亡并抑制其增殖；而在泌尿系恶性肿瘤中，丹参同样发挥着重要作用。Park 等［19］研究报道，从丹参中分离出来的主要成分-隐丹参酮可通过Bcl-2 和MAPK 调节使DU145 前列腺癌细胞对Fas（APO1/CD95）介导的凋亡敏感。Chen 等［20］研究发现，丹参的水性成分丹酚酸B 可抑制YAP1 和Hippo 信号的激活，从而消除了低剪切应力诱导的肾癌细胞上皮-间质转化（EMT），并导致N-钙黏蛋白表达降低，同时下调SNAIL1 和TWIST，并伴有高剪切应力诱发的肾癌细胞凋亡。这些研究均显示出丹参在肿瘤治疗中的潜力，而在膀胱癌中，则分别发现了丹参酮ⅡA 及隐丁胺酮（CTT）均具有治疗作用［21-22］。截至目前，其在膀胱癌中的功效及作用机制仍需进一步探讨。

本研究基于网络药理学分析方法及TCGA 等大数据分析，丹参提取物具备一定的抗癌活性，可通过抑制FASN 的表达进而抑制膀胱癌细胞系的增殖、迁移及侵袭能力。FASN 处于激活状态时，是一种具有7 种不同催化活性的同型二聚体，可在肝脏中产生脂质后输出到代谢活跃的组织或储存在脂肪组织中。免疫组织化学染色表明FASN 水平与乳腺肿瘤大小直接相关［23］，且FASN在肺癌和前列腺癌中高表达，是乳腺癌和前列腺癌的预后不良指标［24-26］。FASN作为癌症和代谢综合征诊疗中的一个潜在靶标已受到越来越多的关注［27-28］。Xiong 等［29］研究发现，FASN 在膀胱癌正常组织和肿瘤组织中表达存在差异，并且与生存相关，可独立预测MIBC 进展，与免疫细胞浸润显著相关，研究进一步发现FASN 低表达的患者对免疫检查点抑制剂治疗反应往往更好。而Deng 等［30］研究发现，二甲双胍可以靶向Clusterin 进而通过SREBP-1c/FASN 轴调控脂肪生成并抑制膀胱癌细胞生长。这些研究展现出FASN 作为促癌基因在膀胱癌这重要功能。本研究在前期数据分析中显示，丹参可下游作用于FASN并在实验中进一步揭示其调控关系，即丹参提取物可抑制FASN表达进而抑制膀胱癌恶性表型。

本研究表明丹参提取物可抑制FASN 表达进而抑制膀胱癌细胞系恶性表型，其有望作为一味中药应用于临床上膀胱癌的预防或治疗；本研究通过科学严谨的研究体系结合大数据挖掘及实验技术等证明了丹参提取物在膀胱癌治疗中的功能机制，同样为后续药物研发提供了新的研究策略。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明 桂志明：酝酿和设计试验，起草文章，获取研究经费；黄健：分析/解释数据，统计分析；李世豪：实施研究；吴昊开：分析/解释数据；汪前亮：采集数据，对文章的知识性内容作批评性审阅，指导