袁 超,喻 昕

(肇庆医学高等专科学校 科研实验中心,广东 肇庆 526020)

周期性发热-阿弗他口炎-咽炎-淋巴结炎(PFAPA)综合征是儿童期最常见的自身炎症性疾病之一,典型的临床症状为高烧(>38 ℃),且无上呼吸道感染的情况,发热时至少伴有口腔炎、咽炎、淋巴结炎3种症状中的一种。发热通常持续2～8 d,每3～8周发作一次,周期性发热至少持续6个月以上。患者在两次发病间期无症状,且生长发育正常,其它可能出现的症状包括腹痛、关节痛等。该疾病常见于5岁以下的儿童,但也有成年人患病的报道。

PFAPA综合征以散发为主,主要呈常染色体显性遗传。虽然PFAPA综合征具体的发病机制尚未明确,但其它以发热为主要表型的自身炎症性疾病,包括家族性地中海热、甲羟戊酸激酶缺乏症、肿瘤坏死因子受体相关周期性综合征、Cryopyrin相关周期性综合征,均表现出单基因突变致病。因此,遗传因素也参与PFAPA综合征的发病,与该疾病相关的致病基因可能包括MEFV、NLPR3、TNFRSF1A、NOD2、MVK。

本研究收集了1例诊断为PFAPA综合征的患者,遗传分析发现了MEFV基因的一个新的突变(c.334G>A,p.E112Q);患者携带该位点的杂合突变,而患者父母均不携带该突变,该突变为一个新发突变。本研究扩展了PFAPA综合征的突变谱。

1 材料和方法

1.1 血液基因组提取

获取知情同意书后,使用EDTA抗凝管采集患者及家属外周血。提取基因组DNA时,将血液转移至离心管并加入红细胞裂解液(Solarbio,中国),充分裂解红细胞后离心收集白细胞,并加入白细胞裂解液(百奥莱博,中国),60 ℃水浴2 h,以3∶1体积比加入乙酸钾溶液(Solarbio,中国)并颠倒混匀。离心收集上清液,使用异丙醇(国药集团,中国)沉淀DNA,并使用75%乙醇清洗DNA 3次。室温放置10 min,DNA充分干燥后,加入Buffer TE(Cwbio,中国),并于50 ℃干浴1 h,振荡混匀后于-80 ℃条件下保存备用。

1.2 全外显子组测序

患者的基因组DNA使用SureSelect试剂盒(Agilent Technologies,美国)进行文库制备以及外显子捕获;使用HiSeq2000测序仪(Illumina,美国)进行全外显子组测序。测序结果经过滤去除接头读长、低质量读长、同义突变以及SNP后,使用NCBI CCDS、RefSeq、Ensembl和Encode数据库对剩余突变进行注释。

1.3 Sanger测序

使用Sanger测序对全外显子组测序测得的突变进行验证。PCR反应在含有20 ng人类基因组DNA的标准PCR缓冲液(50 μL)中进行。使用正向引物(5'-CGCGCCCGGCCCGTTGTTTT-3')和反向引物(5'-CGCCCCCCGCCAGCCCCT-3')对MEFV基因的突变位点进行扩增。PCR的扩增产物使用Cwbio凝胶提取试剂盒(Cwbio,中国)进行纯化,使用BigDye Terminator Cycle Sequencing试剂盒(Applied Biosystems,美国)进行单链扩增,使用ABI 3500遗传分析仪(Applied Biosystems,美国)进行Sanger测序。

2 结果

2.1 病例描述

患者为23月龄的男孩,在11月龄后开始出现周期性发热,每次发热持续4～5 d,每次间隔3～5周。每次发热时,红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)指标升高,并伴有咽炎、扁桃体肿大化脓、淋巴结肿大,无其它临床症状,发热间期恢复正常。患者父母无异常,否认有家族史。患者被诊断为周期性发热-阿弗他口炎-咽炎-淋巴结炎(PFAPA)综合征。

2.2 遗传分析

患者遗传家系图谱如图1所示。对患者的全外显子组测序结果进行分析,发现PFAPA综合征可能的致病基因中仅MEFV基因发生了突变(c.334G>A, p.E112Q)。该突变位于MEFV基因的2号外显子,且尚未见报道,是MEFV基因的一个新的突变。Sanger测序结果(如图2所示)表明,患者携带该位点的杂合突变,而患者父母均不携带该突变,说明c.334G>A是一个新发突变。使用HomoloGene数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene/)对突变的保守性进行分析,不同物种MEFV蛋白的氨基酸序列如图3所示。由图3可知,p.E112位点在不同物种中高度保守,提示该位点可能对MEFV编码的蛋白功能具有重要影响。

图1 患者遗传家系图谱

图2 Sanger测序结果

图3 不同物种MEFV蛋白的氨基酸序列

3 讨论

自身炎症性疾病(Autoinflammatory Diseases,AIDs)是由于固有免疫系统缺陷或失调引起的炎症反应疾病。根据最新的免疫出生错误分类,AIDs可分为I型干扰素病、炎症小体病、非炎症小体相关疾病3大类。AIDs种类多,临床诊断需要参照对应的诊断标准。然而,由于目前对疾病的认识尚不够充分,导致了同一疾病在不同的标准中的诊断指标不尽相同,因此,对于高度怀疑的病例,需要通过基因检测进一步进行确诊。家族性地中海热(Familial Mediterranean Fever,FMF)和PFAPA综合征均是以发热为主要表型的炎症小体病。MEFV基因突变既可能导致FMF,也可能导致PFAPA综合征。然而,FMF的主要表型是反复发热以及浆膜炎,发热持续1～3 d,通常伴有腹痛。本研究发现的病例发热持续时间为4～5 d,不伴有浆膜炎,但每次发热伴有咽炎、扁桃体肿大化脓、淋巴结肿大,符合PFAPA综合征的临床特征,而不符合FMF的临床特征,因此被诊断为PFAPA综合征。

MEFV基因编码Pyrin蛋白。Pyrin蛋白是一种炎症小体蛋白,是先天免疫的感受器,主要定位在粒细胞、单核细胞和树突状细胞,感知各种细菌毒素对宿主细胞Rho GTPases的修饰和失活,在抗细菌天然免疫中发挥重要作用。病原体可以通过调节Rho GTPase的活性来抑制宿主的免疫反应。Pyrin蛋白特异性地感知RhoA小G蛋白的活性变化。在正常的生理状态下,RhoA与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PKN1和PKN2结合,激活的RhoA会通过PKN介导的磷酸化来抑制Pyrin蛋白的活性。病原体感染会下调RhoA活性,并导致Pyrin蛋白活性升高;而MEFV基因的致病突变在没有病原体感染的情况下,会导致Pyrin蛋白活性升高,介导促炎性细胞因子释放,并导致自身炎症性疾病。

MEFV基因突变多见于FMF患者,然而,越来越多的报道表明,PFAPA综合征的患者也携带MEFV基因的突变。Cazeneuve等[1]对6名犹太血统的PFAPA综合征患者进行测序,发现1名患者携带M694V突变;Padeh等[2]对28名阿拉伯和犹太血统的PFAPA综合征患者进行测序,发现6名患者携带M694V杂合突变。然而,这些突变在对应遗传背景中的正常人中的突变频率也较高。因此,这些报道的研究者认为这些突变可能和PFAPA综合征无关。但是,也有研究表明,PFAPA患者携带的这些MEFV基因突变的频率远高于正常人群中的基因突变频率。在健康的土耳其人中,M694V、E148Q、V726A、M680I、M694I的突变频率分别为3%、12%、2%、5%、0%。Gülçin等[3]对157名土耳其PFAPA患者的MEFV基因的这5个位点进行测序,在46名患者中发现了杂合突变,19名携带M694V突变,16名携带E148Q突变,7名携带V726A突变,3名携带M680I突变,1名携带K695R突变;没有患者携带纯合突变。Efrat等[4]对57名以色列PFAPA患者的MEFV基因的这5个位点也进行了测序,发现16名患者携带杂合突变,包括9名携带M694V突变,5名携带V726A突变,2名携带E148Q突变。Seyed等[5]对44名伊朗PFAPA综合征患者进行遗传分析,发现16名患者携带MEFV基因突变,包括13名患者携带E148Q的杂合突变,2名患者携带P369S/R480Q的复合杂合突变,1名患者携带R761H杂合突变。这些结果表明,MEFV基因的突变不仅仅和遗传背景有关,很可能也参与了PFAPA综合征的发病。

其他人种中的MEFV基因的突变也可以导致PFAPA综合征。Taniuchi等[6]对20名日本PFAPA综合征患者进行分析,13名患者携带MEFV基因杂合突变,包括11名患者携带E148Q的杂合突变或包含该位点的复合杂合突变,1名患者携带R202Q的杂合突变,1名患者携带P115R的突变;E148Q的突变频率(44%)显著高于健康人(13%)。1例成年发作的PFAPA综合征患者也携带MEFV基因的E148Q杂合突变[7]。余婷婷等[8]对9名中国的PFAPA综合征患者进行遗传分析,发现4名患者均携带MEFV基因的E148Q杂合突变。和不携带MEFV基因突变的患者相比,携带MEFV基因突变的患者发热持续时间更短,口腔溃疡的频率也更低[6]。本研究发现的PFAPA综合征患者携带MEFV基因E112Q杂合突变。该突变在不同人群中的突变频率均小于0.01,并且该位点在进化中高度保守。因此,患者的表型可能是由于该位点发生了突变,影响了Pyrin蛋白功能所导致。

总之,本研究发现了MEFV基因的一个新发突变(c.334G>A,p.E112Q),扩展了PFAPA综合征的突变谱,进一步明确了MEFV基因的突变会导致PFAPA综合征,增强了对PFAPA综合征的认识,有助于该疾病在临床上的确诊。