任姝晴，宋殿荣，张继雯，怀其娟，赵琳，张崴

生殖健康是当今时代最核心的生命科学问题之一，一项发表在《柳叶刀》杂志上的研究显示，2007—2020 年我国不孕症的发病率已从12%攀升至18%。人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）为不孕症患者带来治疗希望的同时也面临着临床妊娠率仅有30%的巨大挑战[1]。胚胎质量和子宫内膜容受性是影响ART 成功的重要因素，临床反复种植失败的原因有2/3 是子宫内膜容受性不良（poor endometrial receptivity，PER）引起的[2]。目前如何提高子宫内膜容受性是生殖领域亟待解决的难点问题。随着高通量测序技术的不断发展，生殖道微生物在女性生育过程中发挥着重要作用，生殖道菌群失调可能会影响子宫内膜容受性，导致不孕。此外，研究者们发现宫腔并非是无菌的，以乳杆菌为优势菌的ART 患者胚胎种植率和临床妊娠率较高，妊娠结局较好。因此，本研究通过16S rRNA 高通量测序分析PER 不孕症女性宫腔菌群特征，对研究不孕症具有积极意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2021 年7 月—2022 年5 月于天津中医药大学第二附属医院（我院）妇科就诊的不孕症女性。不孕症诊断标准：育龄夫妇双方同居1 年以上，有正常性生活，没有采用任何避孕措施的情况下未能成功受孕称为不孕症[3]。目前超声评估子宫内膜容受性尚无统一的标准和方法，大多数研究采用超声形态学指标和血流动力学指标相结合的方法诊断[4-5]。评估项目：①子宫内膜厚度及形态，取子宫内膜纵切标准图像，取至宫底1.5～2.0 cm 处测量子宫内膜厚度，测量3 次取平均值，并根据图像显示的子宫内膜形态，将子宫内膜分为3 型：A 型为三线型，B 型为过渡型，C 型为均质强回声型。A 型判定为良好，B 型为中等，C 型为不良。子宫内膜厚度≥8 mm 判定为良好，＜8 mm 为不良。②子宫内膜容积，子宫内膜容积的勾边范围为内膜宫底部至宫颈内口间子宫肌层和内膜交界处。子宫内膜容积≥2 mL 评定为良好，＜2 mL 为不良。③子宫动脉血流参数，将超声探头置于宫颈两侧，在彩色血流最明显处用脉冲多普勒测量其频谱，所有的血流均测定至少4～5 个心动周期，通过超声机器自带软件得到子宫动脉的阻力指数（resistance index，RI）、搏动指数（pulsatility index，PI）、收缩期峰值血流速度与舒张末期血流速度比值（S/D）。以RI＜0.85、PI＜3、S/D＜8 判定为良好；以RI≥0.85、PI≥3、S/D≥8 判定为不良。以均满足以上超声评定指标诊断为PER。具体方法：经阴道超声探头频率为3.5～7.5 MHz，伞扩角度为120°，使超声入射与血流方向的角度＜30°，选择在人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）日或黄体转化日进行阴道超声检查。

纳入标准：①年龄20～40 岁；②经诊断确定为PER 不孕症女性及子宫内膜容受性良好的不孕症女性。排除标准：①排除因排卵障碍、盆腔因素和男方因素导致的不孕症；②72 h内进行性生活、盆浴、阴道灌洗，局部上药或正在服用抗生素或停药不超过1 周的患者；③既往患有内分泌疾病，感染性疾病，精神障碍，焦虑抑郁症，肿瘤史，脑、肝、肾、血液系统等重要器官严重疾病，神经、精神疾患无法合作。最终纳入63例不孕症患者，根据超声评估子宫内膜容受性的结果分为PER 组（40 例）和子宫内膜容受性良好的对照组（23 例）。本研究经我院伦理委员会批准，并获得患者及家属知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 取材 使用无菌扩阴器扩张阴道暴露宫颈，用宫颈钳固定宫颈，消毒宫颈管，探针明确子宫腔深度后进行手术，刮取子宫内膜组织，手术时刮匙等避免接触阴道壁。将采集到的样本放入无菌冻存管内，-80 ℃冰箱内保存备检，避免反复冻融。

1.2.2 16S rRNA 高通量测序 提取子宫内膜组织的DNA，对16S rRNA V3～V4 区域进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，使用Qubit（Invitrogen，美国）定量，构建文库，并在Agilent 2100 生物分析仪（Agilent，美国）和Illumina（Kapa Biosciences，Woburn，MA，美国）的文库定量试剂盒上分别评估文库的大小和数量，通过NovaSeq PE250 平台进行文库测序（浙江省杭州联川生物技术股份有限公司），得到特征序列。使用SILVA（release 132）分类器对测序序列进行质控及Feature 聚类，获取Feature 对应的分类单元及其相应丰度信息，根据Feature 分类鉴定结果，获得每个样本在门、纲、目、科、属、种水平的具体组成和丰度。

1.3 统计学方法通过QIIME2 计算α 多样性和β 多样性。采用线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）进行组间显著性差异分析，找到2 组在各水平的生物标志物（Biomarker）。本研究LEfSe 分析的阈值设置为P＜0.05，线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）值＞3.5。采用SPSS 26.0 统计学软件处理数据，符合正态分布的定量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验；定性资料用例数（百分比）表示，组间比较采用卡方检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组患者超声检测参数比较PER 组子宫内膜厚度和子宫内膜容积低于对照组，子宫动脉PI、RI和S/D 高于对照组，2 组子宫内膜分型分布不同，差异均有统计学意义（均P＜0.001）。见表1。

表1 2 组患者超声检测参数比较

2.2 2 组患者一般情况比较2 组患者年龄、月经周期、体质量指数（body mass index，BMI）、不孕时间和不孕类型比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

表2 2 组患者一般情况比较

2.3 16S rRNA 检测结果分析

2.3.1 宫腔菌群物种注释 2 组患者宫腔菌群在门、纲、目、科、属、种水平上均鉴定出多种微生物菌群。见表3。

表3 2 组患者宫腔菌群结构组成分析表

2.3.2 扩增子序列变异（aplication sequence variant，ASV）数目比较 PER 组宫腔特有ASV 数目2 129个，对照组宫腔特有ASV 数目1 011 个，2 组宫腔共有ASV 数目677 个。表明2 组宫腔中存在一些相同微生物物种，但PER 组宫腔微生物物种数高于对照组。见图1。

图1 2 组患者宫腔ASV 数目比较韦恩图

2.3.3 宫腔菌群α 多样性分析 PER 组宫腔菌群Observed、Chao 1、Shannon、Simpson 指数稍高于对照组，但差异无统计学意义（均P＞0.05）。表明2 组患者宫腔菌群α 多样性无显著性差异。见图2。

图2 2 组患者宫腔菌群α 多样性指数小提琴图

2.3.4 宫腔菌群β 多样性分析 对照组宫腔样本个体间群落结构相似趋于聚集，PER 组宫腔样本个体间群落结构差异较大趋于分散。PER 组宫腔菌群个体间差异显著高于对照组（P＜0.05）。见图3。

图3 2 组患者宫腔菌群主坐标分析图

2.3.5 物种组成分析——物种堆叠图 门（Phlyum）水平，PER 组宫腔优势菌门变形菌门（Proteobacteria）相对丰度显著高于对照组（50.52%vs.19.35%，P＜0.05），对照组宫腔优势菌门厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度显著高于PER 组（62.01% vs.36.77%，P＜0.05）。属（Genus）水平，2 组优势菌属均为乳杆菌属（Lactobacillus），PER 组宫腔优势菌属乳杆菌属相对丰度显著低于对照组（21.76%vs.45.96%，P＜0.05），罗尔斯通菌属（Ralstonia）相对丰度显著高于对照组（18.01%vs.0.48%，P＜0.05）。种（Species）水平，PER组宫腔优势菌种未分类的罗尔斯通菌（Ralstonia_unclassified）相对丰度显著高于对照组（18.01% vs.0.48%，P＜0.05），对照组宫腔优势菌种卷曲乳杆菌（Lactobacillus_crispatus）相对丰度显著高于PER 组（23.78%vs.3.82%，P＜0.05）。见图4～6。

图5 2 组患者属水平宫腔菌群相对丰度分布堆叠图

图6 2 组患者种水平宫腔菌群相对丰度分布堆叠图

2.3.6 2 组患者宫腔门、属、种水平菌群相对丰度表达量变化程度的比较 PER 组宫腔厚壁菌门较对照组显著下调（P＜0.05），PER 组宫腔乳杆菌属和卷曲乳杆菌种较对照组下调，但差异无统计学意义（均P＞0.05）；PER 组宫腔变形菌门、罗尔斯通菌属和未分类的罗尔斯通菌种较对照组显著上调（均P＜0.01）。见表4。

表4 2 组患者宫腔门、属、种水平菌群相对丰度表达量变化程度的比较

2.3.7 宫腔差异菌群分析 PER 组宫腔菌群门水平的生物标志物为变形菌门，纲水平生物标志物为变形菌纲，目水平生物标志物为伯克霍尔德菌目，科水平生物标志物为伯克霍尔德菌科、弧菌科、Rhodocyclaceae 和Halomonadaceae，属水平的生物标志物为罗尔斯通菌属、弧菌属、明串珠菌属、Methyloversatilis 和Halomonas，种水平为未分类的罗尔斯通菌、未分类的弧菌、未分类的明串珠菌、未分类的Halomonas。对照组宫腔菌群门水平的生物标志物为厚壁菌门，目水平生物标志物为微小杆菌目和棒状杆菌目，科水平生物标志物为微小杆菌科和棒状杆菌科，属水平生物标志物为微小杆菌属，种水平生物标志物为未分类的微小杆菌和不能培养的乳杆菌。见图7。

图7 2 组患者宫腔菌群差异分析LDA 得分图（Biomarker）

3 讨论

子宫内膜容受性在女性生殖过程中发挥着关键作用。宫腔微环境作为胚胎种植的直接接触环境，宫腔菌群的平衡和稳定对宫腔微环境具有积极意义。随着16S rRNA 测序技术的迅速发展，如今，越来越多的研究表明宫腔菌群与子宫内膜容受性存在一定联系[6-8]。

3.1 PER 患者宫腔菌群特征本研究显示2 组患者宫腔菌群相对丰度均较高的物种有：厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门，这与其他学者报道的不孕症和复发性流产患者宫腔优势菌门的构成是一致的[9-11]。2 组患者宫腔中存在一些相同微生物物种，但PER 组宫腔微生物物种数高于对照组。PER 组宫腔内乳杆菌属和卷曲乳杆菌种相对丰度均显著低于对照组。乳杆菌在宫腔中发挥着重要作用，其主要通过产生乳酸、过氧化氢、细菌素、类细菌素和生物表面活性剂抑制致病菌的生长。此外，乳杆菌可刺激宿主吞噬细胞的能力，同时刺激免疫细胞产生各种细胞因子，如白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、IL-12、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和干扰素（interferon，IFN）等，增强宿主的免疫能力，对早期胚胎着床起到一定作用[12]。然而并非所有的乳杆菌都是有益的，卷曲乳杆菌产生乳酸和过氧化氢能力比惰性乳杆菌强；惰性乳杆菌产乳酸能力较差且不能产生过氧化氢，还可分泌胆固醇依赖性细胞毒素溶血素[13]。因此，宫腔以卷曲乳杆菌为特征的优势菌种可能对子宫内膜容受性具有保护作用。

3.2 PER 患者宫腔差异菌及其与子宫内膜容受性的联系宫腔菌群差异分析显示，PER 组宫腔生物标志物主要包括伯克霍尔德菌科、伯克霍尔德菌目、罗尔斯通菌属和弧菌属等，其中罗尔斯通菌属归属于伯克霍尔德菌科。与本研究较为类似的是，2019年Kitaya 等[6]发现反复种植失败患者有1/4 的子宫内膜样本中检测到了伯克霍尔德菌，而首次体外受精-胚胎移植成功妇女（对照组）样本中均未检测到该菌。2021 年Odawara 等[14]对不孕症患者子宫内膜组织的研究发现，卵泡期常见的菌群依次是乳杆菌、加德纳菌、普雷沃菌、双歧杆菌、伯克霍尔德菌和大肠埃希菌；而黄体期常见的菌群依次是乳杆菌、伯克霍尔德菌、链球菌、加德纳菌、双歧杆菌和奇异菌。可以看出不论是卵泡期还是黄体期，不孕症患者宫腔均有伯克霍尔德菌的存在。国内有学者研究发现与非慢性子宫内膜炎患者比较，慢性子宫内膜炎患者宫腔中存在特征性差异菌群，其中具有诊断效能的分别是伯克霍尔德菌、代尔夫特菌、鞘氨醇单胞菌、苔藓伯克霍尔德菌和刺状鞘氨醇单胞菌等，它们对慢性子宫内膜炎的诊断准确度均为60%～70%[15]。此外，使用左炔诺孕酮宫内缓释节育系统患者的宫腔中常可以检测到伯克霍尔德菌[16]。伯克霍尔德菌也可能是导致输卵管卵巢脓肿的潜在病原体之一[17]。因此，伯克霍尔德菌可能是导致生殖道感染的一种关键致病菌。本研究中伯克霍尔德菌是PER 组的特征菌，提示该菌可能与PER 有关。伯克霍尔德菌、罗尔斯通菌和弧菌都属于革兰氏阴性菌，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁外壁的重要组成成分，可以激活宿主细胞膜表面的Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4），宫腔菌群能与TLR 结合激活丝裂原激活的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和核因子κB（nuclear factor-κB）信号通路并介导子宫内膜发生免疫炎性反应，导致大量细胞因子的表达，包括TNF-α、IL-1β和IL-6 等[18]。宫腔促炎反应与抗炎反应的失衡可能会直接或间接激活子宫内膜慢性炎症反应，影响子宫内膜容受性从而导致着床失败。

综上，宫腔内乳杆菌相对丰度的下降以及特征致病菌伯克霍尔德菌、罗尔斯通菌、弧菌等相对丰度的升高可能与PER 有关，维持宫腔菌群的平衡或许有利于改善子宫内膜容受性。未来，宫腔菌群结构和（或）功能变化与子宫内膜容受性发生、发展的相关性及可能机制仍需要进一步研究来阐明，为从调节宫腔菌群失调的角度预防不孕症奠定基础。