梁 静 杨怡萍 王 冠 雷 磊 车 宇

原发性胆囊癌是肝外胆道常见的恶性肿瘤,发病率居消化道肿瘤的第6位[1-2],早期无特异性症状,就诊时大多已至中晚期,放化疗效果欠佳[3],文献报道胆囊癌根治术后5年生存率不足5%[4]。现已证实免疫逃逸、表观遗传、microRNA等多种因素参与胆囊黏膜从单纯增生到原位癌的发生发展过程[5-6],在PD-1/PD-L1信号通路通过抑制CD4+T细胞、CD8+T细胞的增殖与活化使肿瘤细胞发生免疫逃逸[7]。目前国内外关于靶向PD-1基因的microRNA对胆囊癌细胞生物学特性的文献较少。本文通过microRNA芯片筛选靶向PD-1基因的microRNA,分析其对胆囊癌 GBC-SD细胞的生物学行为的影响,为胆囊癌的免疫治疗提高理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人胆囊癌GBC-SD细胞购自中科院上海细胞库;DMEM培养基(美国Hyclone公司);胎牛血清(美国 Gibco 公司);RT-PCR试剂盒(Fermentas公司);Trizol、LipofectamineTM2000 (Takara公司);双荧光报告基因检测试剂盒(美国Promega公司);PD-1抗体(美国Invitrogen公司);PD-1过表达PCDNA3.1载体、引物设计由大连宝生物工程有限公司设计、合成;Agilent Human miRNA Microarray,Release 21.0(上海数谱生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 GBC-SD细胞培养及PD-1转染 胆囊癌GBC-SD细胞在10%胎牛血清的DMEM培养基中置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育,取对数生长期GBC-SD细胞制备单细胞悬液,置于电击杯内,加入15 μg PD-1过表达PCDNA3.1载体,行电穿孔转染,另取2组细胞做阴性对照、空白对照,3组细胞放入培养箱中孵育48 h后进行后续实验。

1.2.2 PD-1转染后细胞增殖、凋亡的变化 取上述3组细胞,TRIzol法提取各组细胞总RNA,以PD-1引物为模板(上游引物:5'-ATGCTTAGCCTAGAACCGG-3',下游引物:5'TTCCGAAGTCGAGGCCAAG-3'),β-actin为内参,92 ℃预变性 5 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环。取3组对数生长期GBC-SD细胞,0.25%胰酶消化,1×104个/孔浓度接种于96孔板,培养箱中孵育24、48、72 h,加入10 μL CCK8溶液,孵育2 h,酶标仪测定吸光度 (A)值,每实验组设3个复孔。……