胡思雨 王雨楠 徐佳碧 李媛 马骁飞 王勇* 肖殷

（天津大学 理学院1， 化工学院2， 天津 300350）

手性作为物质的一种本质属性，广泛存在于自然界中，构成生命体的氨基酸、蛋白质和核酸等分子都具有手性。当手性药物作用于生物体时，受体分子对构象相反的对映体通常表现出差异性的作用结果[1]。目前，用于临床的人工合成药物约有2000 种，而其中近50%为外消旋体药物，因此，探索能够有效拆分手性对映体的新材料具有重要意义[2-3]。

环糊精（CD）是一类超分子化合物，具有疏水的内腔和亲水的外缘。CD 作为一种良好的手性选择剂，具有空腔结构及手性中心，能够与大量手性分子形成“主客体”包合物[4-5]。因此，CD 在手性拆分领域应用广泛[6]。然而，仅依靠CD 有限的识别位点进行手性拆分的效果并不理想。现有研究虽然已经建立了一系列CD 功能化改性方法，但在CD 手性分离性能方面依然存在较大的提升空间[7-11]。氨基酸作为天然的手性分子[12-13]，具有偶极-偶极、π-π及氢键等作用位点。在早期的研究中，研究人员将L-甘氨酸、L-酪氨酸等天然氨基酸修饰到CD 上，并探讨了其对丹磺酰化氨基酸对映体和硝基苯酚等异构体的分离，结果表明，引入氨基酸不会破坏CD 的包合能力，同时能够提供更多与对映体相互作用的机会，但这仅增加了手性丹磺酰化氨基酸的保留时间，而对其分离选择性影响不大[14-15]，这可能是由于天然氨基酸的作用位点难以与环糊精空腔形成好的协同效应，采用衍生化的氨基酸改性CD 骨架有望获得理想的拆分能力[16]。

基于此，本研究在CD 骨架中引入具有手性结构的异丁酰化L-缬氨酸功能团，并利用“巯基-烯”点击化学反应制备了一种具有全新结构的CD 手性分离材料。相比天然氨基酸，衍生化功能团由于增加了更多的疏水性异丙基及亲水性羰基，能够引入更强的亲疏水相互作用、立体作用及氢键等作用位点，因此，可获得良好的手性拆分性能。利用高效液相色谱（HPLC）考察了此材料对黄烷酮和异噁唑啉等多种手性药物的拆分性能，通过优化分离条件建立了专属的手性分离体系，同时深入研究了异丁酰化L-缬氨酸功能化CD 对同分异构体的分离能力，成功实现了二甲苯异构体的完全分离，并探索了构效关系，为CD 分离材料的开发提供了参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Hitachi 高效液相色谱仪（日本日立公司）；P10SNXP1 高压填柱泵（美国Lab Alliance 公司）；FTS3000 傅里叶红外光谱仪（宁波天美科学仪器有限公司）；TG-DTA8122 热重分析仪（德国耐驰仪器公司）；Vario EL 有机元素分析仪（德国艾力蒙塔公司）；Bruker ACF400 液体核磁共振谱仪（瑞士布鲁克公司）；JEOL JNM ECZ600R 固液核磁共振谱仪（日本电子株式会社）。

缬氨酸、异丁酰氯、三乙胺、N,N-羰基二咪唑（CDI）和NaOH（上海迈瑞尔化学技术有限公司）；浓HCl、无水MgSO4、NH4Cl、β-环糊精（β-CD）、1-烯丙基咪唑、（3-环氧丙氧基丙基）三甲氧基硅烷和（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷（天津希恩思生化科技有限公司）；偶氮二异丁腈（AIBN）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和氯型强碱性阴离子交换树脂（上海麦克林生化科技有限公司）；硅胶（5 μm，10 nm）（日本Fuji 公司）；乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）（天津康科德科技有限公司）。所用化学试剂均为分析纯；合成过程用水为去离子水，色谱过程用水为某品牌饮用纯净水。

1.2 实验方法

固定相材料的具体制备路线如图1 所示。

图1 异丁酰化L-缬氨酸功能化环糊精手性固定相（AI-β-CD-Val-IBAm-CSP）的合成路线Fig.1 Synthesis pathway of isobutylated L-valine functionalized cyclodextrin chiral stationary phase(AI-β-CDVal-IBAm-CSP)

1.2.1 异丁酰化-L-缬氨酸(Val-IBAm)的制备

根据文献[17]的方法制备Val-IBAm。将5 gL-缬氨酸与1.72 g NaOH 溶于50 mL 去离子水中，搅拌0.5 h；在冰浴条件下，缓慢滴加5.49 g 异丁酰氯，用2 mol/L NaOH 调节溶液至pH≥9；常温反应12 h后，在冰浴条件下，用浓HCl 酸化溶液至pH=1，有白色物质析出；继续搅拌2 h，抽滤，产物于80 ℃真空干燥，得到白色粉末Val-IBAm。

液体核磁表征（1H NMR，400 MHz， CDCl3-d）：5.98～5.96（1 H）， 4.58～4.54（1 H）， 2.48～2.44（1 H），2.28～2.23（1 H）， 1.25～1.17（6 H）， 1.00～0.95（6 H）。

1.2.2 单-6-(1-烯丙基咪唑)-CD-氯化物(AI-β-CD)的制备

根据文献[18]的方法制备单-6-（1-烯丙基咪唑）-CD-氯化物。

红外表征（FTIR，KBr）：3337 cm–1（O—H 伸缩振动），2927 cm–1（C—H 伸缩振动），1649 cm–1（C=C伸缩振动），1054 cm–1（C—O—C 对称伸缩振动）。

液体核磁表征（1H NMR，400 MHz，DMSO-d6）：9.15（1 H），7.76～7.73（2 H）， 6.01～5.33（3 H），4.98～4.85（7 H）， 4.57～3.56（42 H）， 2.34（4 H）。

1.2.3 异丁酰化-L-缬氨酸-烯丙基咪唑-β-环糊精(AI-β-CD-Val-IBAm)的制备

称取1.0 g AI-β-CD 于25 mL 圆底烧瓶中，用4 mL 无水DMF 溶解（反应液1）。称取0.5936 g Val-IBAm于25 mL 圆底烧瓶中，加入4 mL 无水DMF 溶解（反应液2）。在冰浴条件下，向反应液2 中缓慢加入0.7710 g CDI，室温搅拌30 min。最后，将上述体系加入到反应液1 中，氮气保护条件下于50 ℃反应48 h。反应结束后，冷却至室温，用MeOH 透析3 d。透析结束后，旋蒸除去MeOH，产物于50 ℃真空干燥。

1.2.4 巯基硅胶(HS-SiO2)的制备

将3.0 g 活化的硅胶（120 ℃真空干燥过夜）加入到30 mL 无水甲苯中，分散均匀，向反应体系中加入0.75 mL（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷，在氮气保护条件下于120 ℃反应8 h。过滤得到固体粗产物，用丙酮索氏提取12 h， 60 ℃真空干燥。

红外表征（FTIR，KBr）：3433 cm–1（硅胶中O—H 伸缩振动），1629 cm–1（C=C 伸缩振动），1108 cm–1（C—O—C 对称伸缩振动）。

1.2.5 异丁酰化-L-缬氨酸-烯丙基咪唑-β-环糊精手性固定相(AI-β-CD-Val-IBAm-CSP)的制备

向30 mL 甲醇-去离子水（1∶1，V/V）混合溶剂中加入1.5 g AI-β-CD-Val-IBAm，充分搅拌使其完全溶解；向反应体系中加入2.0 g HS-SiO2和100 mg AIBN，氮气保护下，在60 ℃下搅拌反应24 h。反应完成后，将反应体系过滤得到粗产物，依次用去离子水、MeOH 和丙酮洗涤，60 ℃真空干燥。

1.2.6 液相色谱柱的填装

采用经典的高压匀浆填充法将所制备的手性固定相（CSP）装入不锈钢柱（50 mm×4.6 mm I.D.）中，以MeOH 为分散剂。装填过程持续约60 min， 装柱压力约3600 psi （1 psi = 6.895 kPa）。

1.2.7 色谱方法

本研究中采用2 种类型的流动相（MP）：（1）MeOH/H2O；（2）ACN/H2O。所有的流动相及分析物溶液在使用前均经过0.45 μm 滤膜过滤，然后进行超声脱气，测试中根据情况调整流动相中不同组分的比例。保留因子（k）、选择因子（α）和分离度（Rs）分别采用以下公式进行计算：

式中，tR为对映体的保留时间；t0为死 时间，由基线波动所决定。

式中，Wh 为色谱峰的半峰宽。

2 结果与讨论

2.1 异丁酰化-L-缬氨酸-烯丙基咪唑-β-环糊精的表征

采用FTIR 和1H NMR 对合成的AI-β-CD-Val-IBAm 进行结构表征。在FTIR 光谱（图2A）中，与AI-β-CD 相比，AI-β-CD-Val-IBAm 在1736 cm–1处出现了C=O 伸缩振动吸收峰，甲基的伸缩振动吸收峰出现在2973 cm–1处，并且在1H NMR 对比图（图2B）中，AI-β-CD-Val-IBAm 化学位移在1 ppm 附近的信号峰归属于Val-IBAm 上的甲基H，以上结果均证明了Val-IBAm 在AI-β-CD 上的固载。通过1H NMR 进行了Val-IBAm 的取代度的计算（见电子版文后支持信息图S1）。结果表明，约有5 个Val-IBAm 分子成功修饰于AI-β-CD，并且通过保护CD 的6 位羟基[19]证明了在CD 的大口端和小口端都发生了Val-IBAm 的取代反应（电子版文后支持信息图S2）。

图2 AI-β-CD-Val-IBAm（a）和AI-β-CD（b）的傅里叶变换红外光谱（FTIR）图（A）和核磁共振（1H NMR）谱图（B）Fig.2 (A) Fourier transform infrared (FTIR) spectrum and (B) proton nuclear magnetic resonance (1H NMR)spectrum of AI-β-CD-Val-IBAm (a) and AI-β-CD (b)

2.2 异丁酰化-L-缬氨酸-烯丙基咪-β-环糊精手性固定相的表征

通过FTIR、热重分析（TGA）、13C NMR 和元素分析对所制备的CSP 进行了表征。在图3A 中，与SH-SiO2相比，从CSP 的曲线中可以明显看到2940 cm–1附近的亚甲基伸缩振动吸收峰，证明AI-β-CDVal-IBAm 成功键合于SH-SiO2表面。以10 ℃/min 的速率从室温升温至800 ℃， CSP 与SH-SiO2的热失重分别为8.3%和23.9%（m/m），重量损失的差异证明AI-β-CD-Val-IBAm 已被成功固载在硅胶表面（图3B）。固体13C NMR 谱图结果表明，相比于SH-SiO2，CSP 在60～110 ppm 处出现了归属于CD 糖环上的碳原子的信号峰，170 ppm 处的信号峰则归属于羰基上的碳原子（图3C）。由元素分析结果（见电子版文后支持信息表S1）可知，CSP 中的C、H 和N 的百分含量与SH-SiO2相比均有较大程度提升，并且S 的含量显著下降，计算得到固定相的环糊精固载量为0.53 μmol/m2，表明通过“巯基-烯”点击化学可成功制备新型环糊精功能化CSP。FTIR、TGA、13C NMR 和元素分析的结果证明成功制备了新型环糊精固定相。

图3 HS-SiO2（a）和手性固定相（CSP）（b）的FTIR 图（A）、热重分析（TGA）曲线（B）和13C NMR 谱图（C）Fig.3 (A)FTIR spectrum,(B)thermogravimetric analysis(TGA)curve and(C) 13C NMR spectrum of HS-SiO2(a)and chiral solid phase (CSP) (b)

2.3 色谱行为评价

为探究所制备的AI-β-CD-Val-IBAm-CSP 的色谱分离性能，本研究选取黄烷酮类和异噁唑啉类的手性药物（对映体结构见电子版文后支持信息图S3）进行色谱分离实验，表1 显示了分析物在最佳流动相条件下的色谱分离结果。探讨了温度和进样量对CSP 拆分行为的影响，并对CSP 进行了稳定性评价。为了更全面客观地评估CSP 的分离性能，选择广泛应用的商业手性色谱柱（CYCLOBOND I 2000）与本研究制备的CSP 进行比较，充分证明了CSP 优越的拆分性能。此外，此新型环糊精CSP 展现了对二甲苯异构体的完全分离能力，进一步表明其在手性和非手性分离领域具有良好的应用潜能。

表1 手性药物在CSP上的色谱拆分结果Table 1 Chromatographic separation results of chiral drugs on CSP

2.3.1 黄烷酮类药物的拆分

黄烷酮类化合物是中草药中一类手性药用成分。分别以MeOH-H2O （50∶50，V/V）和ACN-H2O（50∶50，V/V）为流动相（流速均为0.5 mL/min、柱温均为30 ℃）， 考察了CSP 在不同有机溶剂下的手性拆分性能（电子版文后支持信息图S4）。实验结果表明，以ACN-H2O 为流动相时，样品出峰较快，分离效果较好。在反相高效液相色谱中，ACN 是极性非质子性溶剂，其洗脱能力强于MeOH。因此，后续均以ACN-H2O 为流动相进行实验。在选定流动相种类的基础上，考察了流动相比例对AI-β-CD-Val-IBAm-CSP拆分4 种黄烷酮类药物性能的影响（电子版文后支持信息表S2），最佳流动相条件下的拆分结果见表1，CSP 对4′-羟基黄烷酮和黄烷酮均达到了或接近基线分离，而对于6-甲氧基黄烷酮和7-甲氧基黄烷酮的拆分能力较差（图4）。由分析色谱结果可知，当使用CSP 进行拆分时，黄烷酮类药物位于苯并吡喃酮上的取代基会阻碍分析物的保留并削弱拆分效果，而位于苯环上的取代基则能够促进手性拆分，这主要是因为与CD 的疏水空腔发生“主-客体”包合作用的是苯并吡喃端，因此，苯并吡喃端芳环上的取代基可能成为包合的障碍[20]。此外，4′-羟基黄烷酮的分离度高达2.57，由此推测苯环上对位取代的羟基能够提供强的氢键作用位点，在4′-羟基黄烷酮的色谱拆分过程中具有非常积极的作用。

图4 4 种黄烷酮类手性药物在CSP 上的色谱图（ACN-H2O（20∶80，V/V），0.5 mL/min， 30 ℃）：（A） 4′-羟基黄烷酮；（B） 黄烷酮；（C） 7-甲氧基黄烷酮；（D）6-甲氧基黄烷酮Fig.4 Chromatograms of four flavanone chiral drugs on CSP(ACN-H2O(20:80,V/V),0.5 mL/min,30 ℃):(A) 4′-Hydroxyflavanone ; (B) Flavanone ; (C) 7-Methoxyflavanone; (D) 6-Methoxyflavanone

2.3.2 异噁唑啉类农药的拆分

异噁唑啉类化合物广泛应用在医药和农业等领域。采用制备的AI-β-CD-Val-IBAm-CSP，分别以MeOH-H2O（50∶50，V/V）和ACN-H2O（50∶50，V/V）为流动相（流速均为0.5 mL/min、柱温均为30 ℃），对3 种常见的异噁唑啉类化合物进行分离，考察了CSP 在不同种类流动相下对异噁唑啉类药物的拆分能力（电子版文后支持信息图S5）。结果表明，以ACN-H2O 为流动相时分离效果较好，后续以ACN-H2O 为流动相进行实验。考察了流动相比例对AI-β-CD-Val-IBAm-CSP 拆分异噁唑啉类药物的影响（电子版文后支持信息表S3），最佳流动相条件下的拆分结果列于表1。MDOPh-Ph、4ClPh-Ph 和4MOPh-Ph 这3 种样品在CSP 上表现出较好的分离效果（图5），由于疏水包合作用在样品分离中占主导作用，含有两个苯环的Ar-Phs 疏水性很强，因此与CSP 形成的包合物稳定，可以形成有效的手性拆分三点作用模型[21]。其中，MDOPh-Ph 和4ClPh-Ph 达到基线分离，4MOPh-Ph 接近基线分离，不同的基团取代在同一位置存在不同的分离结果。

图5 3 种异噁唑啉类手性药物在CSP 上的色谱图：（A） 4ClPh-Ph; （B） MDOPh-Ph; （C） 4MOPh-PhFig.5 Chromatograms of three isoxazolines chiral drugs on CSP:(A)4ClPh-Ph;(B)MDOPh-Ph;(C)4MOPh-Ph色谱条件(Chromatographic conditions):(A)ACN-H2O(30∶70,V/V); (B)ACN-H2O(30∶70,V/V); (C)ACN-H2O(20∶80,V/V);0.5 mL/min, 30 ℃

2.4 温度和进样量对CSP拆分行为的影响

以4′-羟基黄烷酮作为测试样品，保持流动相条件（ACN-H2O （40∶60，V/V），流速为0.5 mL/min，30 ℃）不变，考察了温度和进样量对CSP 手性拆分行为的影响（图6），结果见电子版文后支持信息表S4和S5。随着温度升高，α和Rs减小，这是因为分子热运动增加，削弱了环糊精空腔及其它作用位点与样品之间的相互作用，导致样品被快速洗脱。由图6B 可见，进样量的多少直观地反映在色谱峰高。适当增大进样量可以提高检测的灵敏度和准确度，但α和Rs会随进样量增加而略降。

图6 温度（A）和进样量（B）对CSP 拆分行为的影响（ACN-H2O （40∶60，V/V），0.5 mL/min，30 ℃）Fig.6 Effects of temperature(A)and injection volumn(B)on CSP resolution behavior(ACN-H2O(40∶60,V/V),0.5 mL/min, 30 ℃)

2.5 CSP稳定性评价

为了考察CSP 的稳定性及重现性，以4′-羟基黄烷酮为代表进行长期稳定性实验。由图7A 可见，储存70 d 后，CSP 仍然对4′-羟基黄烷酮表现出良好的分离重现性，说明CSP 具有优异的稳定性。为了进一步考察CSP 在酸碱环境下的稳定性，选取丹磺酰缬氨酸（Dns-val）进行测试，用pH = 3.5 或pH = 9 的流动相以0.5 mL/min 连续冲洗24 h。由图7B 和图7C 可见，即使长时间暴露于酸性或碱性流动相后，色谱柱的保留时间、峰形、Rs和α几乎没有变化（电子版文后支持信息表S6），说明CSP 具有良好的酸碱稳定性。

图7 （A）长期稳定性测试：a，初始分离；b，60 d；c，70 d；ACN-H2O（20∶80，V/V），0.5 mL/min， 30 ℃）。（B）酸性环境下稳定性测试：a，初始分离；b，连续冲洗24 h；pH=3.5；MeOH-1%TEAA（80∶20，V/V），pH=3.5，0.5 mL/min， 30 ℃）。（C）碱性环境下稳定性测试：a，初始分离；b，连续冲洗24 h；pH=9；MeOH-1% TEAA （80∶20，V/V），pH=9.0，0.5 mL/min， 30 ℃）Fig.7 (A) Long-term stability test: a, initial separation; b, 60 d later; c, 70 d later; ACN-H2O (20∶80, V/V),0.5 mL/min,30 ℃.(B)Stability test under acid mobile phase:a,initial separation;b,flush continuously for24 h;pH=3.5; MeOH-1% TEAA (80∶20, V/V), 0.5 mL/min, 30 ℃.(C) Stability test under basic mobile phase: a,initial separation; b, flush continuously for 24 h; pH=9.0; MeOH-1% TEAA (80∶20, V/V), 0.5 mL/min, 30 ℃

2.6 与其它色谱柱的对比

比较了AI-β-CD-Val-IBAm-CSP 与商业手性色谱柱（CYCLOBOND I 2000）、文献中其它手性色谱柱[21]以及氨基酸修饰的CD 色谱柱[15]的识别能力。从电子版文后支持信息表S7 可知，CYCLOBOND I 2000对这7 种物质均不能分离，对比其它手性色谱柱CSP2[22]（15 cm × 4.6 mm）， CSP 对黄烷酮类和异噁唑啉类具有更好的分离效果，证明AI-β-CD-Val-IBAm-CSP 在手性药物分离中具有良好的应用前景。此外，为了更充分地证明CSP 的优异性能，以L-酪氨酸修饰的CD 固定相TCDS 作为比较对象[15]，通过比较TCDS（15 cm×4.6 mm）和CSP（5 cm×4.6 mm）对丹磺酰缬氨酸和丹磺酰苯丙氨酸的选择性因子（电子版文后支持信息表S7），发现CSP 表现出与之相当的选择性，对丹磺酰缬氨酸和丹磺酰苯丙氨酸表现出一定的拆分能力（电子版文后支持信息图S6），证明了AI-β-CD-Val-IBAm-CSP 的优异性能。

2.7 二甲苯异构体拆分研究

在考察CSP 手性分离性能的同时，进一步尝试将其用于邻、间、对-二甲苯异构体的分离。作为化学化工领域极为重要的原材料及中间体，二甲苯异构体的分离被认为是分离难题之一[23]。目前已经有很多材料被用于二甲苯异构体的分离，如金属有机框架[24]、分子筛[25]和石墨烯量子点[26]等，其中，以CD 衍生物作为固定相、应用色谱分离技术分离二甲苯异构体的研究也引起广泛关注。本研究通过异丁酰化L-缬氨酸对CD 进行修饰，制备的新型CSP 具备对二甲苯异构体的完全分离能力（图8），相关数据见电子版文后支持信息表S8。此外，进行了邻、间、对-二甲苯3 种组分出峰顺序的确定（电子版文后支持信息表S9），通过与单一组分样品的保留时间进行对比，可以确定在CSP 上的出峰先后顺序依次为对-二甲苯、间-二甲苯和邻-二甲苯。推测这些同分异构体的保留能力与其取代基位置有关：邻-二甲苯的保留时间较长，而对-二甲苯的保留时间较短，表明CSP 对分析物可能具有特异性识别和形状选择的能力。CSP 对邻-二甲苯的保留较强可能是由于邻-二甲苯的两个甲基之间的间距最短[27]，使其能够进入异丁酰化L-缬氨酸修饰后的环糊精空腔；对-二甲苯取代基之间的间距大于间-二甲苯，因此包合相对不稳定，在3 个异构体中保留最弱。

图8 二甲苯异构体在CSP 上的色谱图（MeOH-H2O （50∶50，V/V），0.5 mL/min， 30 ℃）Fig.8 Chromatogram of xylene isomers on CSP(MeOH-H2O (50∶50, V/V), 0.5 mL/min, 30 ℃)

3 结论

在CD 骨架中引入异丁酰化L-缬氨酸功能团，并利用“巯基-烯”点击化学反应合成了一种全新结构的环糊精CSP，采用高效液相色谱对黄烷酮和异噁唑啉两类手性对映体进行了分离，证实此CSP 具有优异的手性拆分能力。在优化对映体色谱拆分条件的基础上，进一步探讨了相关的手性分离机理。考察了温度和进样量对手性拆分效果的影响，评价了此新型CSP 的稳定性。此新型CSP 对二甲苯异构体这类非手性样品具有完全分离能力。本研究证明了基于CD 的CSP 在手性和非手性分离领域的应用潜能。