伍小艳,石伟,韩忠耀

(1.桂林市卫生学校,广西 桂林 541006;2.广西师范大学,广西 桂林 541006;3.黔南民族医学高等专科学校,广西 都匀 558000)

民族药大接骨丹树皮来源于山茱萸科植物有齿鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的干燥树皮,其根皮收载于贵州省地方药、民族药标准《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003版)[1]。据文献报道,大接骨丹树皮具有抗炎镇痛活性[2]。目前,大接骨丹树皮未被历版《中国药典》和地方标准收载,根据贵阳中医学院编著《中华本草》(苗药卷)记载和相关文献报道,民族药大接骨丹树皮具有药用开发价值,具有替代用药部位根皮的潜在价值[3-4]。

据相关研究报道,大接骨丹主要含有4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛[5]、Griselinoside[6]、紫丁香苷[6]、Coniferin[6]、Quercetin-3-O-glucoside[6]、Astragalin[6]、Phytol[6]、黑麦草内酯[7]、苹果酸甲酯[7]、griselinoside[7]等化学成分。当前,有齿鞘柄木相关研究主要集中指纹图谱[8-13]、工艺优化[14]、近红外快速分析[15-17]、质量标准与质量标准提升[18-19]、生物活性[20]、含量测定[21-22]、液质联用成分分析研究[23-24]、谱效关系探究[25]、生药学研究[26]等,而关于大接骨丹树皮药材质量标准研究,尚未见报道。

本试验拟以黔产大接骨丹树皮药材为研究对象,按照国家药品标准及相关文献,对6批次大接骨丹树皮药材进行薄层色谱定性鉴别,水分、总灰分、浸出物的含有量检测,同时,建立HPLC法测定大接骨丹树皮药材紫丁香苷的含量,为民族药大接骨丹树皮药材质量标准制定与质量控制提供参考与试验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型HPLC分析仪(DAD检测器,美国安捷伦科技有限公司);FA2125型电子天平(十万分之一,上海舜宇恒平科学仪器有限公司);SX-4-10型箱式电阻炉(天津市泰斯特仪器有限公司);101-3AB型烘箱(天津市泰斯特公司);三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司);DY-D2电热恒温水浴锅(上海胜启仪器仪表有限公司);JP-020超声仪(深圳洁盟清洗设备有限公司);蒸发皿;坩埚等。

1.2 试药

紫丁香苷对照品(购自成都克洛玛生物科技有限公司,批号为:160120);硅胶GF254薄层板(上海艾研生物科技有限公司);甲醇(天津科密欧化学试剂有限公司,分析纯);乙腈(天津科密欧化学试剂有限公司,色谱纯);水为自制蒸馏水,其他试剂均为分析纯。

6批大接骨丹树皮药材均为自采(见表1),所有自采药材均黔南民族医学高等专科学校药物化学与药物分析教研室韩忠耀教授鉴定为山茱萸科植物有齿鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的树皮。

表1 大接骨丹树皮药材来源

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴

按照文献相关方法[18-19],取大接骨丹树皮药材粉末2 g,置圆底烧瓶中,加甲醇50 mL,水浴回流提取60 min,滤纸过滤,滤液置坩埚中,水浴蒸干(水浴温度≤70 ℃),放冷至室温,残渣用移液枪加入甲醇2 mL,溶解,制备成供试品溶液,即得;参考文献[18]方法,取适量紫丁香苷标准品,加甲醇制成每1 mL含该成分约为1 mg的溶液,即得紫丁香苷标准品溶液。参照2020版《中国药典》(四部)0502薄层色谱测定法[27]并参考文献[19]方法,吸取供试品溶液、对照品溶液各5 μL,点于同一硅胶GF254薄层板上,按照参考文献[18]薄层层析展开剂条件为本试验展开剂,展开、晾干,紫外光灯254 nm下检视,在供试品、对照品色谱相应的位置上显相同颜色的蓝紫色荧光斑点,见图1。喷以10%硫酸乙醇溶液,用吹风机加热数分钟至斑点显色清晰,在供试品、对照品色谱相应的位置上显相同灰蓝色斑点,见图2。

图1 大接骨丹树皮药材TLC荧光(254 nm)结果

图2 大接骨丹树皮药材TLC(10%硫酸乙醇)结果

2.2 检查项及浸出物

2.2.1 水分测定

参照2020版《中国药典》(四部)通则0832水分测定法第二法(烘干法)[27]并参考文献[18-19]相关方法,进行水分检查,各批次平行2份,结果见表2。根据检测结果,初步拟定大接骨丹树皮药材水分含有量不得超过12.0%。

表2 6批大接骨丹树皮药材水分含量、浸出物含量及灰分含量测定结果

2.2.2 总灰分测定

参照2020版《中国药典》(四部)通则2302总灰分测定法[27]并参考文献[18-19]相关方法,进行总灰分检查,各批次平行2份,结果见表2。根据检测结果,均值为6.03%,以总灰分不超过平均值的120%为限度计算,初步拟定大接骨丹树皮药材总灰分含有量不得超过7.23%。

2.2.3 浸出物测定

参照2020版《中国药典》(四部)2201浸出物测定法(热浸法)[27]并参考文献[18-19]相关方法,进行浸出物测定,溶剂为70%乙醇,各批次平行2份,结果见表2。根据检测结果,均值为21.10%,以浸出物不少于平均值的70%为最低限度要求计算,初步拟定大接骨丹树皮药材浸出物含有量不得少于14.77%。

2.3 紫丁香苷含量测定

2.3.1 色谱条件

参照《中华人民共和国药典》(2020年版,四部,0512高效液相色谱法测定)[27]及文献按照文献[19,21]相关方法,紫丁香苷HPLC检测条件:Agela Promosil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),检测波长210 nm,进样量5 μL,柱温35 ℃,体积流量为1.0 mL·min-1,流动相为0.5%-磷酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱条件,见表3。

表3 接骨丹树皮药材HPLC梯度洗脱程序

在此条件下,紫丁香苷理论塔板数大于4 000,与相邻成分色谱峰的分离度大于1.5,色谱图见图3。

图3 对照品(A)与供试品(B)的 HPLC图

2.3.2 对照品溶液的制备

按照文献相关方法[19,21],取紫丁香苷标准物质适量,精密称定,置于25 mL白量瓶中,加入甲醇,摇匀,即得对照品储备溶液(每1 mL含1.235 3 mg的紫丁香苷)。

2.3.3 供试品溶液的制备

按照文献相关方法[19,21],精密称取药材粉末(过50目筛孔孔径0.282 mm药典筛)约0.5 g,精密称定,记录称样量,置于具塞锥形瓶中,加入甲醇50 mL,水浴回流提取60 min,过滤于50 mL量瓶中,甲醇稀释至刻度,摇匀,滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.3.4 线性关系考察

按照文献相关方法[19,21],精密量取“2.3.2”项下标准品储备溶液0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL,分别置于5 mL量瓶中,用分析纯甲醇稀释至刻度,摇匀,按“2.3.1”项下色谱条件和表3流动相梯度洗脱方法,以紫丁香苷峰面积为纵坐标(Y),溶液的质量浓度为横坐标(X)作线性回归方程,得到紫丁香苷线性回归方程为Y=2 927.4X-17.227(r=0.999 9),线性范围为0.123 5～1.235 3 mg/mL。

2.3.5 精密度试验

按照文献相关方法[19,21],精密吸取“2.3.4”项同一质量浓度的对照品溶液(3号线性紫丁香苷标准品溶液),按“2.3.1”项下色谱条件和表3流动相梯度洗脱方法,连续进样6次,测得紫丁香苷色谱峰面积RSD为1.88%(n=6),结果表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验

按照文献相关方法[19,21],取S1供试品药材粉末共6份,按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液,于0,2,6,10,12,24 h,按“2.3.1”项下色谱条件和表3流动相梯度洗脱方法进样,测得紫丁香苷含量RSD为2.15%,说明样品溶液在24 h内稳定。

2.3.7 重复性试验

按照文献相关方法[19,21],取S1供试品药材粉末共6份,按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.3.1”项下色谱条件和表3流动相梯度洗脱方法,连续进样6次,测得紫丁香苷含量RSD为1.96%,表明该方法重复性符合要求。

2.3.8 加样回收率试验

按照文献相关方法[19,21],取紫丁香苷对照品适量,精密称定,置50 mL量瓶中,摇匀,即得每1 mL含1.023 3 mg。取S1供试品药材粉末共6份,每份约0.1 g,精密称定,按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液,滤液分别精密加入5.0 mL紫丁香苷对照品溶液,用甲醇稀释至刻度,用0.45 μm微孔滤膜过滤,续滤液分别置于液相小瓶中,测得其平均加样回收率为102.33%,RSD为2.52%。表明该方法回收率较好。

2.3.9 含量测定

按照文献相关方法[19,21],精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5 μL,按“2.3.1”项下色谱条件和表3流动相梯度洗脱方法进样分析,含量测定结果见表4。根据检测结果,以紫丁香苷含量不低于平均值的70%为最低限度要求计算,初步拟定大接骨丹树皮药材紫丁香苷含量不得低于19.39 mg·g-1。

表4 大接骨丹树皮药材含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 薄层色谱条件系统考察

薄层色谱鉴别研究过程中,筛选了提取方法、不同提取溶剂对大接骨丹树皮药材提取效果的影响,结合薄层层析效果,选定本试验研究对象TLC定性分析的提取溶剂与提取方法。同时,重点考察了不同展开溶剂对大接骨丹树皮药材定性鉴别的效果,研究发现以本课题组前期研究基础的三氯甲烷-甲醇-水(体积比15∶4∶0.2)为展开剂[18],TLC定性鉴别效果较佳。

3.2 含量测定检测波长的选择

采用Agilent 1260型高效液相色谱仪DAD检测器,多波长筛选紫丁香苷检测波长,研究发现,当检测波长为210 nm时,大接骨丹树皮药材中紫丁香苷分离度高、峰型较好,因此,确定大接骨丹树皮药材中紫丁香苷含量测定的检测波长为210 nm。

3.3 检查项及浸出物

参考文献[18-19],并依据该药材所含成分的理化性质,最终确定水分测定法采用烘干法,浸出物测定采用热浸法且以70%乙醇为溶剂,灰分检测总灰分。

本试验对大接骨丹树皮药材薄层色谱定性鉴别、水分含有量、总灰分含有量、浸出物含有量、紫丁香苷含量测定方法,进行了较为系统的研究,结果显示:大接骨丹树皮药材中紫丁香苷在0.123 5～1.235 3 mg/mL范围内,线性关系良好,相关系数r值为0.999 9,紫丁香苷平均加样回收率为102.33%,RSD为2.52%;6批大接骨丹树皮药材水分、总灰分、浸出物含有量分别为8.28%～10.53%,4.84%～7.16%,15.63%～22.45%。试验可为大接骨丹树皮药材的临床用药、药材的质量控制以及质量标准拟定,提供数据参考。