吴志明 袁振兴 勒春 曹正柳 万欣 周易芬 张鹏 （.南昌大学第一附属医院中医科 南昌 0000；.九江市第六人民医院中医科 江西 九江 000；.南昌大学第二附属医院中医科 南昌 0000）

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis,PMO）主要表现为绝经后老年女性骨量减少，骨结构变化引起髋关节及椎体压缩性骨折等［1-2］。PMO使老年人骨折风险﹑致残风险及死亡率显著升高，增加公共卫生负担［3］。雌激素替代疗法是预防和治疗PMO 进展和降低骨折风险的现代医学经典的治疗方法［4］。然而，雌激素替代疗法可能导致乳腺癌﹑妇科肿瘤及冠心病等心血管疾病的发生［5］。因此，急需寻找疗效较佳﹑副作用较小的天然替代品预防和治疗骨质疏松引起的骨质流失和骨折风险。补肾壮骨方组成为生地黄15 g，知母15 g，补骨脂12 g，巴戟天12 g，淫羊藿15 g，枸杞子12 g，酸枣仁10 g，黄柏10 g,具有补肾宁心，燮理阴阳的功能。其不仅能有效地改善围绝经期妇女的神经症状，同时对绝经后骨质疏松有良好的防治作用。预试验结果发现围绝经期妇女在口服补肾壮骨方后，外周血雌激素（estrogen 2，E2）水平无明显变化，Th 细胞比例显著增加。本实验通过ELISA 分析补肾壮骨方对绝经后骨质疏松小鼠模型性激素水平及骨生化指标的影响，Western blot 分析补肾壮骨方对成骨细胞和破骨细胞EphB4﹑Ephrin-B2 蛋白表达的影响，Micro-CT 成像检测体内骨密度及骨小梁参数，进一步阐明该复方防治绝经后骨质疏松的疗效与作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物与试剂

补肾壮骨方：江西省国医名师曹正柳创立，包含生地黄15 g， 知母15 g，补骨脂12 g，巴戟天12 g，淫羊藿15 g，枸杞子12 g，酸枣仁10 g，黄柏10 g。此方剂中所有中药饮片均由南昌大学第一附属医院中药房提供，按照每100 g 中药饮片配比800 mL 饮用水，按常规煎煮方法进行制备。其后，进行过滤浓缩至生药2.5 g/mL，成品储存于4 ℃恒温冰箱之中。雌激素组采用戊酸雌二醇片（补佳乐，拜耳医药上海有限公司，批号J20171038），成人日用量1 mg，换算成小鼠为每天0.13 mg/kg，小鼠每天灌胃容量为0.10 mL/10 g，雌二醇溶液含药量为0.013 mg/mL，配制好后置于4 ℃冰箱中贮存备用。E2﹑FSH﹑LH 性激素ELISA 试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，货号1530503688﹑1533849327﹑1533697166）；Ca﹑P﹑ALP 骨生化指标试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，货号1529396445﹑1535598798﹑TE0009）；EphB4 抗体﹑Ephrin-B2 抗体﹑GAPDH 抗体（英国Abcam 公司，货号xy50582-R039﹑Hz-10659R﹑ab9484）。

1.2 主要仪器

170/3940 型转膜仪（英国伯乐公司）；PVDF膜（美国Millipore 公司）；超净工作台（苏州集团安泰空气技术有限公司）；万分之一分析天平（上海精科仪器有限公司 )；自动平衡离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；超低温冰箱（德国贺利氏公司）；微量移液器（德国Gilson 公司）；Micro-CT系统（德国Siemens AG 公司）；双能X 骨密度仪（美国 Hologic 公司）。

1.3 动物

清洁级雌性 BALB/c 小鼠50 只，12~13 月龄，体重（21.51±1.20）g，购自南昌大学第一附属医院实验动物中心，合格证号：SYXK（赣）2021-0003。实验期间，小鼠给予常规喂养，自由进食﹑饮水，动物房内环境稳定室温保持在22~26 ℃，相对湿度保持在40%~60%，保持良好的通风。本研究涉及的动物实验经过南昌大学第一附属医院伦理委员会批准，伦理编号：（2021）医研伦审第（9-006）号。

1.4 分组及模型建立

实验小鼠根据随机数字表法分为5 组，分别为正常对照组﹑假手术对照组﹑去势手术组﹑补肾壮骨方组﹑雌激素组。去势手术组给予雌性BALB/c小鼠氯胺酮100 mg/kg 麻醉，之后经背部入腹切除双侧卵巢；假手术组在卵巢附近切除与卵巢质量大致相等的脂肪组织，不对卵巢做任何处理；灌药6 周后，从正常对照组﹑假手术对照组及去势手术组随机取2 只置于双能X 线吸收测量仪平台上测定股骨骨密度（BMD），根据 BMD 含量判断是否造模成功。

1.5 给药方法及剂量

正常对照组：正常喂食，按0.10 mL/10 g 体重灌服生理盐水，每日1 次，连续灌胃12 周。假手术对照组：按0.10 mL/10 g 体重灌服生理盐水，每日1 次，连续灌胃12 周。去势手术组：去势手术造模成功后，按每天0.10 mL/10 g 灌服生理盐水，每日1 次，连续灌胃12 周。补肾壮骨方组：去势手术造模成功后，按0.10 mL/10 g 体重灌服补肾壮骨方，每日1 次，连续灌胃给药12 周。雌激素组：去势手术造模成功后，雌激素组按含药量0.013 mg/mL相应溶液0.1 mL/10 g 灌胃，每日1 次，连续灌胃给药12 周。

1.6 标本的采集与处理

各组小鼠末次给药24 h 后，小鼠称重，用氯胺酮100 mg/kg 对各组小鼠进行麻醉，麻醉状态下通过摘眼球取血，所取全血置于室温下2 h，以3 000 r/min 离心20 min，分离血清，采用ELISA法检测血清性激素及骨生化指标。取血结束后脱颈处死小鼠，酒精浸泡消毒后完整取出双侧股骨。

1.7 实验检测指标及方法

1.7.1 ELISA 检测血清E2﹑FSH﹑LH 性激素及Ca﹑P﹑ALP 骨生化指标 各组小鼠采集全血后进行提取血清，保存于-80 ℃低温冰箱备用。ELISA 实验操作依照厂家说明书，最后分别计算E2﹑FSH﹑LH性激素及Ca﹑P﹑ALP 骨生化指标的血清浓度。

1.7.2 Western blot 检测骨组织中EphB4﹑Ephrin-B2蛋白表达 分别收集各组小鼠右侧股骨组织，置于预冷的生理盐水中，剔除骨外膜，用蒸馏水清洗干净血液等杂质，之后剪碎骨组织进行称重，后将碎骨放入装有液氮的研钵中研磨成粉末状。研磨完成后放入离心管中，每100 mg 骨粉末加入300 µL 蛋白提取试剂，轻轻混匀，冰浴30 min，每5 min 用漩涡混合仪振荡20 s。最后在12 000 r/min转速条件下离心15 min，所得上清液为骨组织总蛋白。蛋白变性后进行SDS-PAGE 凝胶电泳和转膜反应，将膜放入封闭液中，用TBST 稀释脱脂牛奶至浓度为5%，室温下脱色及封闭60 min，加入所需EphB4﹑Ephrin-B2 一抗和二抗进行免疫反应。以GAPDH 作为参照进行实验指标检测。

1.7.3 Micro-CT 检测骨密度和骨结构参数 各组小鼠处死后，迅速取小鼠左侧股骨，去除附着的软组织，将骨组织固定在4%多聚甲醛溶液中。将股骨标本置于标本杯中固定，采用体外Micro-CT 断层扫描技术对股骨骨密度﹑骨结构进行扫描。扫描条件设置为电压70 kV，扫描电流200 μA，层间距14.80 μm，平面分辨率300 ms，连续扫描约808 层。检测骨密度（BMD）﹑骨体积/ 总体积（BV/TV）﹑小梁骨数目（Tb.N）和小梁厚度（Tb.Th）。

1.8 统计学方法

数据使用SPSS 21.0 统计软件进行分析，实验结果用均数±标准差（）表示，每组间用单因素方差分析，以P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠体重的比较

实验开始前及第6 周各组小鼠的体重无统计学意义，12 周后去势手术组﹑雌激素组小鼠体重均高于正常对照组﹑假手术对照组及补肾壮骨方组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 各组小鼠不同时间点体重变化（，n=10） g

表1 各组小鼠不同时间点体重变化（，n=10） g

注：与正常对照组比较，△P<0.05；与假手术对照组比，▲P<0.05；与去势手术组比较，＃P<0.05。

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2.2 各组小鼠血清性激素水平的比较

去势手术组小鼠FSH﹑LH 水平明显高于正常对照组﹑假手术对照组﹑补肾壮骨方组及雌激素组，差异具有统计学差异（P<0.05）；去势手术组小鼠血清E2水平低于其他4 组，差异具有统计学意义（P<0.05）；雌激素组E2水平高于正常对照组﹑假手术对照组﹑补肾壮骨方及去势手术组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清E2、FSH、LH含量的比较（，n=10）

表2 各组大鼠血清E2、FSH、LH含量的比较（，n=10）

注：与正常对照组比较，△P<0.05；与假手术对照组比，▲P<0.05；与去势手术组比较，＃P<0.05。

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2.3 各组小鼠血清骨生化指标的比较

去势手术组小鼠血清ALP 明显高于正常对照组﹑假手术对照组﹑补肾壮骨方组及雌激素组，差异具有统计学差异（P<0.05）；去势手术组小鼠血清Ca﹑P 含量明显低于其他4 组（P<0.05）。见表3。

表3 各组小鼠血清骨生化指标的比较（，n=10）

表3 各组小鼠血清骨生化指标的比较（，n=10）

注：与正常对照组比较，△P<0.05；与假手术对照组比，▲P<0.05；与去势手术组比较，＃P<0.05。

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2.4 补肾壮骨方对各组小鼠BMD 及骨参数的影响

去势手术组小鼠BMD﹑BV/TV﹑Tb.Th 低于正常对照组﹑假手术对照组﹑补肾壮骨方组及雌激素组，差异具有统计学意义（P<0.05），补肾壮骨方组与雌激素组中BMD﹑BV/TV 低于正常对照组与假手术组，差异具有统计学意义（P<0.05）。各组小鼠Tb.N 比较差异均无统计学意义（P>0.05） 。见表4。

表4 各组小鼠骨密度参数和骨结构参数的比较（，n=10）

表4 各组小鼠骨密度参数和骨结构参数的比较（，n=10）

注：与正常对照组比较，△P<0.05；与假手术对照组比，▲P<0.05；与去势手术组比较，＃P<0.05。

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2.5 各组小鼠EphB4、Ephrin-B2 蛋白水平

Western blot 检测提示，EphB4 蛋白表达在去势手术组中低于正常对照组﹑假手术对照组﹑补肾壮骨方组及雌激素组，差异具有统计学意义（P<0.05），补肾壮骨方组与雌激素组低于正常对照组与假手术对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；Ephrin-B2 蛋白表达在去势手术组显著高于其他4 组，具有统计学意义（P<0.05），补肾壮骨方组与雌激素组高于正常对照组与假手术对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表5﹑图1。

图1 各组小鼠EphB4、Ephrin-B2蛋白表达情况

表5 各组小鼠EphB4、Ephrin-B2蛋白水平（，n=10）

表5 各组小鼠EphB4、Ephrin-B2蛋白水平（，n=10）

注：与正常对照组比较，△P<0.05；与假手术对照组比，▲P<0.05；与去势手术组比较，＃P<0.05。

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3 讨论

骨质疏松症是一种累及全身的代谢性疾病，表现为骨组织内部微细结构出现变化，导致骨组织脆性增加，骨量减少［6］。绝经后骨质疏松症是临床中常见的一种骨质疏松症，对绝经后妇女造成巨大影响。此外，研究发现大约80%的骨折与骨质疏松症相关，即使骨折经过治疗后愈合，患者生活质量亦受较大影响［7-8］。成骨细胞（osteoblast，OB）和破骨细胞（osteoclast，OC）在维持骨量和骨强度过程中起到非常重要的作用，不断更新骨基质，OC 将旧骨或受损骨移除，并由OB 形成新骨，这一高度协调的过程被称为骨重塑［9］。骨重塑障碍是导致骨质疏松的常见原因［10］。在OB 和OC 维持的骨代谢平衡中，OB 起着非常重要的作用，而目前应用的经典抗骨质疏松药物（降钙素﹑二磷酸盐﹑雌激素等），多为抑制OC 活性的药物，缺乏刺激OB 活性或既刺激OB 又抑制OC 的药物。因此，在深入研究和发掘化学合成药物时，应注重中药的开发应用［11］。

本实验研究发现卵巢切除后的去势手术组小鼠体重高于正常对照组﹑假手术对照组及补肾壮骨方组，给予补肾壮骨方处理的卵巢切除的小鼠体重增加不明显，低于雌激素组及去势手术组，提示补肾壮骨方治疗绝经期后骨质疏松时无雌激素样增加体重的副反应。针对补肾壮骨方对小鼠血清性激素及骨生化指标的影响发现，补肾壮骨方不增加性激素FSH﹑LH 与骨生化指标ALP 水平，能够提高卵巢切除术后小鼠性激素E2及骨生化Ca﹑P 水平，血清Ca﹑P 水平能够间接反映骨代谢情况。众所周知，骨重塑的过程是动态的，维持骨量和骨质量，限制过度矿化的骨在体内的积累，并通过释放Ca 和P 的储备保持矿物质的平衡。当血液中的Ca含量下降时，甲状旁腺激素分泌增加，导致骨质中的Ca 进入血液中，引起骨质疏松。提示补肾壮骨方治疗绝经期后骨质疏松时无明显雌激素样副反应，具有较好临床应用前景。

骨密度是目前公认的用于评估骨质疏松严重程度及治疗疗效的一项非常重要的检测指标［12-13］。骨质疏松症表现为骨重塑障碍，骨转换率增加，BMD 和骨结构参数BV/TV﹑Tb.N 和Tb.Th 等降低。本研究发现去势手术组小鼠BMD﹑BV/TV﹑Tb.Th显著低于正常对照组﹑假手术对照组﹑补肾壮骨方组及雌激素组（P<0.05），补肾壮骨方能够改善卵巢切除后导致的BMD﹑BV/TV﹑Tb.Th 下降，改善去卵巢引起的骨质疏松症。因给予药物干预时间较短，补肾壮骨方组与雌激素组中BMD﹑BV/TV低于正常对照组与假手术组，持续更长时间使用补肾壮骨方BMD﹑BV/TV 可能会渐接近正常值。

Eph 受体家族是酪氨酸蛋白激酶受体最常见的亚家族，它的配体是Ephrin 家族的蛋白质，分为A和B 两种类型［14］。成骨细胞膜上的EphB4 受体与破骨细胞膜的Ephrin-B2 配体结合抑制破骨细胞的形成，促进体外成骨细胞的分化［15］。

研究发现EphB4/Ephrin-B2 信号通路既有正向信号又有反向信号，呈双向性，其中反向信号抑制破骨细胞分化，正向信号调节成骨细胞的功能和活性［16-17］。研究发现Ephrin-B2 配体和EphB4受体在成骨细胞膜上同时表达，Ephrin-B2 配体在破骨细胞膜上也有表达［18-21］。当配体与受体结合时，2 条下游信号通路都被激活。当成骨细胞膜上EphB4 受体与破骨细胞膜上Ephrin-B2 配体结合，激活下游信号通路，抑制破骨细胞的成熟，这被称为“反向信号”。相反，当Ephrin-B2 与成骨细胞膜上的EphB4 结合时，会促进成骨细胞的矿化，这被称为“正向信号”［22］。根据以往的数据，推测补肾壮骨方通过EphB4/Ephrin-B2 轴缓解绝经后骨质疏松。

本研究发现EphB4 蛋白表达在去势手术组显著低于正常对照组﹑假手术对照组﹑补肾壮骨方组及雌激素组，提示补肾壮骨方可提高成骨细胞膜上EphB4 蛋白表达；Ephrin-B2 蛋白表达在去势手术组显著高于其他4 组，补肾壮骨方组与雌激素组高于正常对照组与假手术对照组，提示补肾壮骨方可能抑制成骨细胞和破骨细胞膜上Ephrin-B2蛋白表达。

综上所述，补肾壮骨方治疗绝经期后骨质疏松临床效果显著且无明显增加体重副反应，其能够升高血清E2水平，降低FSH﹑LH 水平，增加EphB4蛋白表达，抑制Ephrin-B2 蛋白表达，无雌激素样副反应，提示其可能通过EphB4/Ephrin-B2 轴缓解绝经后骨质疏松，为临床治疗绝经后骨质疏松提供理论依据。