郭敏 李建民 刘建辉 杨宁 张静 李玉秋 程菲 刘旭枝 贺强 和苗 杨文娟

(1.河北省血液中心，河北 石家庄 050071；2.河北省人民医院 输血科)

为提高血液资源的利用率和缓解临床应用血小板的紧张状况，以及作为技术贮备和战略贮备等新高度要求，在借鉴国内白膜法[1-3]制备去白细胞混合浓缩血小板成功经验的基础上，针对国内起始血液采集规格[4](200 mL/300 mL/400 mL)与国外[5](450 mL/500 mL)有所不同的国情面前，以及国内用于制备去白细胞混合浓缩血小板血袋厂家可供耗材的特性，并结合单位自身实际情况及采取一些改良做法的基础上，通过白膜法来制备去白细胞混合浓缩血小板并将其应用到临床，现就其中40 例制备、质量控制及临床应用的跟踪案例情况进行调查回顾，并与去白细胞单采血小板40 例的质量及临床应用情况进行对比，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 带留样装置400 mL 采血联袋(山东威高，如图1所示)，带白细胞过滤器的T 型汇集联袋(山东威高，如图2所示)，KUBOTA-9942 离心机(日本久保田)，微电脑配平仪(山东威高)，TSCD-Ⅱ无菌接驳机(日本泰尔茂)，XHZ-Ⅳ血小板恒温振荡保存箱(苏州市医用仪器厂)，mindray BC-6600血细胞计数仪(深圳迈瑞生物)，ADAM-rWBC 残留白细胞计数仪(纳若恩态)，MC 电子天平(杰力衡器)， FJ-Ⅰ型分浆夹板(苏州市医用仪器厂)，SE-250 热合机(韩国申通)，BacT/ALERT 3D(480)全自动细菌培养仪(瑞士梅埃理)。

图1 带留样装置采血袋

图2 T 型去白汇集联袋

1.2 方法

1.2.1 制备浓缩血小板起始血液采集方法及贮存条件要求

使用带留样装置400 mL 四联采集袋按操作规程要求对制备浓缩血小板的起始血液进行采集[6]及贮存[7]。

1.2.2 起始血液的离心条件 在血袋配平后，以2 800 g，14 min，20～24℃，刹车设置3，为条件进行离心。

1.2.3 血浆量控制式白膜的分离提取方法 将离心后起始血液置于分浆夹板内，先将上部血浆转移第一个转移袋中直至血浆约剩30 mL 左右时(约一横指高度，宁少勿多)止流，将白膜收集袋置于电子秤上，称重记录数值，再将残留血浆缓慢转移至白膜袋中并称重(通过血浆密度可换算成mL)和记录，然后将白膜连同一定量红细胞(以多收集白膜和少损失红细胞为双控手法)一起转移至白膜收集袋中(要求分离的白膜挤过三通)并止流，并依白膜袋中初始收集的血浆量为基础水平，白膜袋中血浆量不足40 mL 者，用第一转移袋中血浆(可通过对血浆进行轻微摇晃产生泡沫)进行回补(此操作可较为准确控制白膜中的血浆量，其次可达到冲洗导管和提高白膜回收率等多重效果)至40 mL，最后将MAP添加至红细胞袋中并混匀，热合断离成悬浮红细胞和含白膜的两部分。

1.2.4 白膜的贮存及解聚要求 分离后的白膜置于20 ～24℃血小板振荡保存箱内非振荡保存下进行自然解聚，解聚时间最长≤24 h。

1.2.5 白膜汇集合并去白细胞混合浓缩血小板的制备方法

在检测结果合格后，将同血型400 mL 起始血液制备的7袋白膜(血浆含量为40 mL)，使用带白细胞过滤器的T 型汇集联袋，通过无菌连接逐一进行合并，合并中注意充分混匀、减少白膜挂壁状况，使之集中至第1 个汇集袋中，热合去除不需要的部件；合并后白膜经配平后，以400 g、10 min、20～24℃、刹车设置3，为离心条件进行离心，离心后，如上部血浆分层好、无红细胞挂壁状况，则将混合白膜离心后置于分浆夹板内进行分离，将上部血浆经血小板型白细胞过滤器转移至血小板保存袋中，即制备成去白细胞的混合浓缩血小板；离心后，如上部血浆分层不好、有红细胞挂壁状况，则将上部血浆转移至第2 个转移袋中，热合去除不需要的部件，再次进行轻离心，离心后再重复上述分离操作，即制备成去白细胞的混合浓缩血小板。

1.2.6 去白细胞混合浓缩血小板质量评判依据 以《全血及成分血质量要求》(18469-2012)中去白细胞单采血小板质量控制要求[8]及以团体标准(T/CAME 11-2020)《去白细胞混合浓缩血小板的制备和质量控制》的质量控制要求[9]对制备的去白细胞混合浓缩血小板质量进行评判。

1.2.7 血细胞计数及白细胞残留量检测方法 按mindray BC-6600 血细胞计数仪和ADAM-rWBC 残留白细胞计数仪厂家说明书的操作要求，对单一和混合的浓缩血小板制品进行相关的数据检测。

1.2.8 血小板细菌培养方法 按BacT/ALERT 3D(480)全自动细菌培养仪厂家说明书操作要求，完成血小板的BPN厌氧菌和BPA 需氧菌的细菌培养。

1.3 对照组设置 为验证去白细胞混合浓缩血小板质量及临床疗效，本实验选用对等空白条件下，去白细胞单采血小板样为对照对象(由MS＋、Trima、Amicus 血小板采集仪及配套耗材按各自操作说明书采集制备)，组成对照组样例。

1.4 去白细胞混合浓缩血小板临床输血是否有效的评判方法 一是通过CCI(the corrected count of increment)指标进行判定，CCI 是通过检测患者输注血小板1 h 或24 h 后的血小板计数来评价血小板输注后的实际效果。 通常认为，输注1 h后的CCI＜7 500 或输注24 h 后的CCI＜4 500，应考虑血小板输注无效，其计算公式[10]为:CCI ＝PI(×109/L)×体表面积(m2)/输注血小板的绝对数量(×1011)×1 000，式中输注后血小板增加数(PI)＝输注后血小板计数-输注前血小板计数；体表面积＝0.006 10×患者身高(cm)＋0.012 80×患者体重(kg)＋0.015 29；1 000 为调节系数。 二是通过PPR(percentage of platelet recovery)指标进行判定，计算输注1 h 后的PPR＜30%或输注24 h 后的PPR＜20%，应考虑血小板输注无效，其PPR 计算公式[10]为:PPR(%)＝PI(×109/L)×总血容量(L)/[输注血小板的绝对数量(×1011)×100×F]×100%，式中总血容量＝患者的体重×0.07；一般脾功能正常的患者F＝0.62，无脾患者F＝0.91，脾肿大患者F＝0.23。

1.5 临床输用对象情况 年龄在19 ～61 岁之间，患有包括急慢性白血病、再生障碍性贫血、骨髓纤维化、淋巴瘤、骨质增生异常、多发性骨髓瘤、干燥综合症、免疫性血小板减少性紫癜等疾病的男女患者，并根据身高、体重等指标测算出相应指数，选择血小板输注后24 h 来计算的CCI 和PPR 并作为输注效果评价的衡量指标。

1.6 统计方法 采用SPSS17.0 统计软件中配对t检验对相关数据进行统计和结果分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组和对照组血小板产品的质量检测情况 跟踪调查实验组40 例去白细胞混合浓缩血小板和对照组40 例去白细胞单采血小板产品的质量检测结果，如表1 所示。

表1 实验组和对照组血小板产品的质量检测情况

2.2 实验组和对照组血小板临床应用效果观察情况 如表2 所示。

表2 实验组和对照组血小板临床应用效果观察情况

3 讨论

我国2018 年全国发出单采血小板177.9 万单位、手工血小板发出52.4 万单位[11]，手工血小板总占比为22.8%，而国外输血事业发达国家如法国临床使用混合浓缩血小板比率达51.6%， 德国为38.5%， 瑞士为35.0%，英国为19.3%(2012 年为14.7%)[12]，以及在欧美国家，机制血小板的临床使用占所有血小板种类的40%～50%，而白膜法(BC-PC)制备血小板占临床使用血小板总数的80%[13]。 对比发现国内手工血小板临床应用和国外还存在一定差距，导致这种差距的原因是多方面的，如标准制约、制备耗材不全、传统理念束缚等，但从节约和充分利用血液资源以及作为技术贮备和战略贮备等新高度要求角度出发，去白细胞混合浓缩血小板制备及临床应用都值得重视和关注。

去白细胞混合浓缩血小板不单纯是个制备活，其涵盖了原料耗材、工艺技术、软硬件技术、质量控制和质量保证等等方面，可相互影响亦可相辅相成。 随着去白细胞混合浓缩血小板相关标准的出台以及与制备紧密关联的使用耗材的技术成熟和批准上市，为其制备奠定了坚实基础。 本文在制备去白细胞混合浓缩血小板上，采取了一些旨在保证产品质量和确保临床治疗效果的做法。 1)耗材选择:选择带留样装置采集袋的目的是预防血液采集过程中的血液细菌污染；使用血小板保存袋存放白膜是延长其保存时间便于后续的汇集操作；使用带白细胞过滤器的T 型汇集联袋是出于以下考虑，一是采用无菌连接汇集操作可确保多袋汇集时不发生细菌污染，二是如果发生离心效果不佳导致血小板中红细胞混入量过高时，可采取再次轻离心的补救操作以去除多余红细胞，降低血小板中红细胞混入量，三是在分离过程中可同时进行滤除白细胞的操作以提高效率。 2)单一血小板血浆量及去白细胞混合浓缩血小板总容量控制:单一白膜分离中留存40 mL 血浆的意义在于，一是当血小板悬浮储存于35～40 mL 血浆时，其恢复率和存活率都很好[5，20]，且欧盟相关标准中也要求血浆的容量应＞40 mL[14]这一规定，尽管这一要求与国内标准要求的浓缩血小板容量50 ～76 mL[8]不尽相同，但并不影响产品质量，且在容量超负荷控制方面更具优势。如以此容量并以7 袋为基准进行1 个治疗量去白细胞混合浓缩血小板制备，其总容量在350～532 mL 的范围内，大大超出《全血及成分血质量要求》(18469-2012)中去白细胞单采血小板质量控制要求[8]及以团体标准《去白细胞混合浓缩血小板的制备和质量控制》(T/CAME 11—2020)[9]血小板容量即250～300 mL 之要求。 另外，制备中采取的血小板先期容量控制方法，与文献报道的全血制备的血小板平均体积减少至最终体积为15 ～20 mL/U 时，体外性质如血小板形态、平均血小板体积、低渗休克反应、聚集和血小板因子3 活性可保持在储存5 d 的体积减少的血小板中[5，21]的出发点一致，具有解决容量超标问题及无需别的补救措施等优点。3)采取7 袋汇集做法的原由:一则较单一血小板最低量血小板计数要求(≥4.0×1010)更容易满足起始血液随机采集、制备这一双盲(采集和制备前血小板计数检测并非常规化的操作)现状；二则考虑到血小板滤除白细胞过程中损失(不同质量滤器损失消耗量一般为10%～15%)，其最低标准理论计算结果为:血小板计数(×1011)＝4.0×1010×7×(1-10)%≈2.52×1011(≥2.50×1011)，仍能满足相关标准要求，如果单一血小板中存在计数值相对高者，其最终计数值则更会高，这一做法也与文献报道的如需过滤，血小板袋数应适当增加1～2袋，以补充过滤、留取标本的消耗[15]的做法有异曲同工的效果；三则以7 袋为基准进行一个治疗量去白细胞混合浓缩血小板制备时，可确保其总容量控制在250 ～300 mL 的范围内，一般平均在280 mL 左右内，此举，可防止单一白膜中血浆量过多导致的汇集后总容量过多，会加重输注者的循环压力[16]的风险；四则选择以7 袋为基准进行汇集的做法，随着白膜层储存时间的延长，血小板对外界刺激的敏感性降低，使本已经形成微聚体的血小板充分解聚[17]，更有利于血小板回收率的提高，血液标本的酶免加核酸检测一般用时为48 h＞白膜解聚的最长24 h 用时，也就是说在检测结果合格后采取的多袋白膜汇集时，白膜均可达到较好的解聚效果；五则固定式制备操作更有利于标准化和规范化操作，可操作性好，可更加确保产品质量，较文献报道的用7 人份400 mL全血中白膜汇集制备混合浓缩血小板，又经洗涤去上清后再加入200 mL 血浆以控制产品总容量在250 mL 左右[18]的做法更加简便有效，但在单人血浆和多人血浆悬浮血小板上，单人血浆在抗体和感染风险上切实较多人血浆有优势，目前情况下可在分离非悬浮用单一白膜时尽可能减少血浆用量以降低混合血浆量比重，且这种风险将来会随着血小板保存添加剂的应用而得到极大改善和解决。 4)制备中应注意的一些细节问题:一是一次离心时选择相对较大的离心力可提高白膜回收率、保证正常规格量血浆、在白膜压实程度及白膜解聚时间达12 h 以上时并不影响浓缩血小板回收率；二是针对血小板中的红细胞混入量，因白膜汇集后容积变大，血袋装杯时更易保持直立效果，再加上采用海绵填充法[19]加持，可增强直立效果和在离心过程中减少壁挂红细胞现象，对降低血小板中红细胞混入有实效，与文献报道的混合浓缩血小板中红细胞混入量低[20]的结论一致。 5)进一步拓展制备的设想:一则在制备中采取和选择一些别的做法能够带来进一步的好处，但也增加了一定的困难程度，如理论上单一产品中血小板计数值更高，在合并混合后其血小板计数值也应更高，这就给汇集份数递减(如4～6 袋)提供了可能；二则若采集量少单日不足完成治疗量汇集的可从两日量中去完成；三则血小板保存添加剂批准上市后，对去白细胞混合浓缩血小板制备带来的新变化。 从实验的结果上看，本实验产品质量无论是在血小板容量、血小板计数、红细胞混入量和白细胞残留量等指标上均可符合相关标准要求，与去白细胞单采血小板质量并无明显差异，同时设计的制备方法相对简便易行，可操作性强，但仍存在逐步完善及持续改进之处。

文献报道血小板成分中去除白细胞显著降低了HLA 免疫(初级免疫减少＞80%，二级免疫减少40%)[21]，而接受血小板输注的患者高达40%可发生同种免疫导致的输注无效，这种风险已被证明通过所有血液成分的普遍滤除白细胞而减少[22]，本实验滤除混合浓缩血小板中的白细胞的目的也正在于此，且滤除效果符合国家相关标准要求。 另文献报道在单采血小板和混合浓缩血小板的比较中，针对非异变致敏受者两种产品的治疗作用是等效的[23]，这说明混合浓缩血小板除特定需求外，完全可以满足其他的治疗要求，这与表2的调查结果相一致。

综上所述，针对去白细胞混合浓缩血小板，只要制备方法得当，其质量及临床应用效果与去白细胞单采血小板基本相当，在应对临床血小板供应紧张时不失为一种很好的补充策略。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。