陈 曦，朱 玲，李 靖，许国莹，叶耘峰

（江苏护理职业学院，江苏 淮安 223003）

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，它对人类健康构成严重威胁，在所有恶性肿瘤中的死亡率排名第四。结直肠癌在治疗效果和预后方面存在高度异质性，即使是病理类型和临床分期相同，其疗效和预后也可能存在显著差异［1］。上皮-间质转化（EMT） 是一类生物调控过程，是正常发育中所必需的。但EMT 也在纤维化的发生等多种病理条件下发挥重要作用，并且与肿瘤的发生发展密切相关，包含改变细胞结构，促进肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖等［2］。肿瘤的侵袭与迁移是导致肿瘤患者出现不良预后的主要原因之一，是恶性肿瘤重要的生物学特征。越来越多的研究证明EMT 在结直肠癌的发生发展中至关重要。

积雪草酸是一种已知的三萜类物质，具有抗炎、降低血糖血脂、神经保护、抗抑郁等多种重要的生物活性［3］。目前已有研究报道积雪草酸对舌癌、乳腺癌等的恶性肿瘤具有良好的体外抑制作用［4-5］，课题组前期研究发现积雪草酸能够增强结肠癌HCT116 细胞对临床常规化疗药物奥沙利铂的敏感性。本研究以结肠癌HCT116、SW480 细胞为研究对象，探讨积雪草酸对结肠癌细胞迁移及侵袭能力的影响，并基于Wnt/β-catenin 信号通路初步探讨其作用机制，为积雪草酸用于结肠癌的临床治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞株 人结肠癌HCT116 与SW480 细胞购自美国ATCC 细胞库，用含10%胎牛血清的1640 培养基于37 ℃、5%CO2、相对湿度95%的恒温细胞培养箱中培养。

1.2 试剂与药物 积雪草酸（批号JXCS20200603） 购自南京春秋生物工程有限公司； 胎牛血清 （ 货号SH30084.02）、RPMI 1640 培养基（货号SH30809.01B） 购自美国HyClone 公司； CCK-8 试剂（货号CA1210） 购自北京索莱宝科技有限公司； 二甲基亚砜 （DMSO，货号276855）、Wnt/β-catenin 信号通路激动剂 LiCl （货号L9650） 购自美国Sigma 公司； Giemsa 染液（货号C0133）购自上海碧云天生物技术有限公司； Transwell 小室（货号3422a） 购自美国Corning 公司； Matrigel 基质胶 （货号356234） 购自美国BD 公司； SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（货号BL502B）、4% 多聚甲醛（货号BL539A） 购自合肥白鲨生物科技有限公司； NC 膜（货号HF13502S25） 购自美国Millipore 公司； 波形蛋白（Vimentin，货号5741T）、β-连环蛋白 （β-catenin，货号 8480T）、c-myc （货号18583S）、细胞周期蛋白1 （cyclin D1，货号55506T）、存活蛋白（survivin，货号2808T）、HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体（批号32935S） 购自美国Cell Signaling Technology 公司；肌动蛋白抗体（β-actin，货号BS6007M） 抗体购自美国Bioworld 公司； 神经性钙粘附蛋白 （N-Cadherin，货号A19083）、Snail （货号A5243）、上皮性钙粘附蛋白 （ECadherin，货号A3044）、基质金属蛋白酶2 （MMP2，货号A11144）、基质金属蛋白酶9 （MMP9，货号A0289） 抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。

1.3 仪器 TS100 型倒置显微镜（日本尼康公司）； 细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）； MINI-4 小型垂直电泳仪及转膜系统（北京凯元信瑞仪器有限公司）； iMark酶标仪（美国Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 药物配制 精密称取积雪草酸适量溶于无菌DMSO中，配制成积雪草酸溶液（母液20 mmol/L，-20 ℃保存），给药时以培养基稀释至实验所需剂量； 精密称量LiCl溶于无菌培养基中，给药剂量为20 mmol/L。

2.2 CCK-8 法检测细胞存活率 取对数生长期细胞，每孔5 000 个接种于96 孔板，约70% ～80% 细胞贴壁后加入含0.1%DMSO （对照组） 及10、20、30、40、50、60 μmol/L积雪草酸溶液的完全培养基（含10%胎牛血清） 分别处理24 h，弃去培养基，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃培养箱避光孵育2 h，于450 nm 波长处检测光密度（OD）值，计算细胞存活率。

2.3 细胞形态观察 收集对数生长期细胞均匀接种于6 孔板中，贴壁后设置积雪草酸低、中、高剂量组（10、20、30 μmol/L），另设置对照组给予含0.1% DMSO 的完全培养基，培养24 h 后于显微镜下观察并拍照。

2.4 划痕实验检测细胞迁移能力 收集对数生长期细胞均匀接种于6 孔板中，按“2.3” 项下方法进行分组给药。使用无菌枪头垂直划线，PBS 洗涤2 次后，继续培养48 h，分别于0、48 h 观察并拍照，计算细胞划痕愈合率，公式为细胞划痕愈合率＝ ［（0 h 划痕面积-24 h 划痕面积） /0 h划痕面积］ ×100%。

2.5 Transwell 实验检测细胞迁移、侵袭能力 收集对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后使用无FBS 培养基重悬，计数后接种于小室上层，每孔200 μL （细胞密度为2.5×105/mL），小室下层加入600 μL 含10% 胎牛血清的培养基，按“2.3” 项下方法进行分组给药。48 h 后弃去培养液，PBS 洗涤3 次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗涤3次，Giemsa 染液染色30 min，PBS 洗涤3 次，擦去小室上层细胞。随机选择3 个视野，计数穿膜细胞数。侵袭实验则用无血清培养基按1 ∶10 比例稀释Matrigel 胶，并将其均匀平铺在Transwell 小室上层（每孔50 μL），培养箱水化2 h后，其余步骤同迁移实验。

2.6 Western blot 法检测细胞 MMP-9、MMP-2、Ncadherin、Vimentin、Snail、β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin 蛋白表达 收集对数生长期细胞，均匀接种于6 孔板中，培养24 h，待细胞融合率达70% ～80% 后，按“2.3” 项下方法进行分组给药，作用24 h 后，收集各组细胞，提取总蛋白。使用10% SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，随后转膜，5%脱脂奶粉溶液封闭30 min，TBST 洗膜3 次，每次5 min，一抗（1 ∶1 000） 4 ℃过夜孵育，TBST 洗膜3次，每次5 min，二抗（1 ∶10 000） 孵育1 h，TBST 洗膜3次，每次5 min，ECL 化学发光法显影，Image J 软件分析蛋白灰度值，β-actin 为内参，计算目的蛋白相对表达。

2.7 Wnt/β-cantenin 通路在积雪草酸调控结肠癌细胞迁移、侵袭中的作用 收集对数生长期HCT116 细胞，均匀接种于6 孔板中，培养24 h，设置对照组（0.1% DMSO）、积雪草酸组（20 μmol/L）、积雪草酸+LiCl 组（积雪草酸20 μmol/L，LiCl 20 mmol/L），Transwell 迁移、侵袭实验步骤同“2.5” 项，Western blot 实验步骤同“2.6” 项。

2.8 统计学分析 通过SPSS 19.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，组间两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 积雪草酸对HCT116 和SW480 细胞存活率的影响 与对照组比较，给药剂量高于20 μmol/L 时，积雪草酸对HCT116、SW480 细胞的增殖均具有抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），且随着给药剂量的增加，增殖抑制效果增强。积雪草酸处理HCT116 与SW480 细胞24 h 后的IC50值分别为45.34、34.97 μmol/L，故选择10、20、30 μmol/L 剂量进行后续实验，见图1。

图1 积雪草酸对HCT116 和SW480 细胞存活率的影响（±s，n＝3）

3.2 积雪草酸对SW480 和HCT116 细胞形态的影响 对照组SW480、HCT116 细胞呈梭形，细胞触角明显； 积雪草酸各剂量组SW480、HCT116 细胞随着药物剂量逐渐增加，部分细胞触角变短，形状逐渐规则，细胞失去间质型细胞形态特征，呈现上皮型细胞形态特征，见图2。提示积雪草酸对SW480 和HCT116 细胞的上皮间质转化进程产生抑制作用。

图2 积雪草酸对HCT116 和SW480 细胞形态的影响（×100）

3.3 积雪草酸对HCT116 和SW480 细胞迁移能力的影响与对照组比较，积雪草酸各剂量组SW480、HCT116 细胞划痕愈合率降低（P＜0.01），且呈剂量依赖性，见图3。与对照组比较，积雪草酸各剂量组SW480 与HCT116 细胞迁移率降低（P＜0.01），且呈剂量依赖性，见图4。提示积雪草酸能够有效抑制SW480、HCT116 细胞的迁移。

图3 积雪草酸对HCT116 和SW480 细胞划痕愈合能力的影响（×40，±s，n＝3）

图4 积雪草酸对HCT116 和SW480 细胞迁移能力的影响（×100，±s，n＝3）

3.4 积雪草酸对HCT116 和SW480 细胞侵袭能力的影响与对照组比较，积雪草酸各剂量组SW480、HCT116 细胞侵袭率降低（P＜0.01），且呈剂量依赖性，见图5。提示积雪草酸能降低SW480 和HCT116 细胞侵袭能力。

图5 积雪草酸对HCT116 和SW480 细胞侵袭能力的影响（×100，±s，n＝3）

3.5 积雪草酸对 HCT116 细胞 MMP-9、MMP-2、Ncadherin、Vimentin、Snail 蛋白表达的影响 根据细胞划痕与Transwell 迁移及侵袭实验结果，积雪草酸对HCT116 细胞的体外转移抑制效率较高，故选择其进行蛋白表达验证。与对照组比较，积雪草酸各剂量组HCT116 细胞MMP-9、MMP-2、N-cadherin、Vimentin、Snail 蛋白表达降低 （P＜0.05，P＜0.01），E-cadherin 蛋白表达升高（P＜0.01），且呈剂量依赖性，见图6。

图6 积雪草酸对HCT116 细胞MMP-9、MMP-2、N-cadherin、Vimentin、Snail 蛋白表达的影响（±s，n＝3）

3.6 积雪草酸对HCT116 细胞β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin 蛋白表达的影响 与对照组比较，积雪草酸各剂量组HCT116 细胞β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈剂量依赖性，见图7。

图7 积雪草酸对HCT116 细胞β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin 蛋白表达的影响（±s，n＝3）

3.7 Wnt/β-cantenin 通路在积雪草酸调控结肠癌细胞迁移、侵袭中的作用 与积雪草酸组比较，LiCl+积雪草酸组HCT116 细胞迁移、侵袭率升高（P＜0.05，P＜0.01），Ncadherin、β-catenin 蛋白表达升高 （P＜0.01），E-cadherin蛋白表达降低（P＜0.01），见图8。提示Wnt/β-catenin 信号通路激动剂LiCl 处理可逆转积雪草酸对结肠癌细胞迁移与侵袭的抑制作用。

图8 LiCl 逆转积雪草酸对HCT116 细胞迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响（×100，±s，n＝3）

4 讨论

结直肠癌是目前发病率较高的临床恶性肿瘤，预计到2030 年全球负担将增加60%［6］。伴有远处转移的结直肠癌患者的5 年生存率较低，50%的转移患者会在5 年内复发并死亡［7-8］，并且几乎所有的结直肠癌患者都会产生化疗药物的耐药性，限制其疗效，最终导致治疗失败［9-10］。因此，为改善结直肠癌患者的临床治疗效果及提升预后，开发安全有效的抑制肿瘤转移的临床新药物势在必行，上皮间质转化已被报道为上皮细胞来源的肿瘤细胞迁移和侵袭的重要生物学过程［11］。

研究证实，积雪草酸对多种肿瘤细胞的生长及转移具有抑制作用。积雪草酸可以促进乳腺癌细胞凋亡与细胞周期阻滞，有效抑制人乳腺癌细胞MCF-7 和MDA-MB-231 的生长，还能够通过PI3K/Akt 信号通路抑制WAVE3 的激活，从而抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231 的侵袭［12］。积雪草酸通过介导线粒体损伤促进肺癌细胞的凋亡，并抑制TGF-β1 诱导的肺癌A549 细胞上皮间质转化［13-14］。积雪草酸还可以诱导内质网应激并激活Grp78/IRE1α/JNK 和Calpain 通路抑制舌癌的生长［15］。同时，也有研究初步证实积雪草酸对结肠癌细胞迁移具有抑制作用［16］。本研究深入探讨了积雪草酸抑制结肠癌细胞迁移、侵袭、上皮间质转化的作用及其机制。

金属基质蛋白酶（MMPs） 家族能够降解细胞外基质中各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，与肿瘤的转移与浸润高度相关，在人类结肠癌中MMP-2 与MMP-9均过量表达［17-18］。MMP-9 和MMP-2 的高表达会减弱基底膜的屏障作用，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭［19］。本研究通过划痕愈合与Transwell 迁移及侵袭实验证实积雪草酸对HCT116 与SW480 细胞转移的抑制作用，并通过Western blot 结果证实积雪草酸可抑制结肠癌HCT116 细胞的MMP-9、MMP-2 表达，并剂量依赖性地抑制间质指标N-cadherin、Vimentin、Snail 表达，促进上皮指标E-cadherin 表达，从而抑制细胞EMT 进程。

Wnt/β-catenin 信号通路主要由细胞外因子（Wnt）、跨膜受体卷曲蛋白、β-catenin 和T 细胞因子等组成，已被证实在结直肠癌的转移中出现过度激活，这一异常激活增加Snail 的转录，并抑制E-cadherin，促进上皮间质转化，最终导致肿瘤侵袭性增加［15］。且Wnt/β-catenin 信号通路的异常激活可调控其下游靶基因cyclinD1、c-myc 和survivin，进一步促进结直肠癌的发生、增殖、迁移和侵袭［17，20］。本研究显示，积雪草酸可有效抑制结肠癌HCT116 细胞Wnt/βcatenin 信号通路相关蛋白β-catenin、c-myc、cyclin D1 和survivin 的表达，抑制效果呈剂量依赖性，且Wnt/β-catenin信号通路激动剂可逆转积雪草酸对结肠癌细胞迁移、侵袭及EMT 相关蛋白与β-catenin 蛋白表达的作用。

综上所述，积雪草酸能够抑制结肠癌细胞HCT116 与SW480 的迁移、侵袭及EMT 进程，且抑制作用呈现剂量依赖性，而这一作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin 信号通路活化有关。