张佩琛，方 栋，郝海军

（1.郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州 450064； 2.河南大学，河南 郑州 450000； 3.上海雷允上药业有限公司，上海 201401）

吴茱萸碱是吴茱萸主要活性成分之一，属于吲哚类生物碱［1］，具有抗肿瘤、镇痛、抗炎、调节内分泌等作用［2-4］，可通过调节JAK2/ STAT3 通路蛋白表达、抑制胃黏膜组织Gli1-Gli2-Sufu 信号通路转导等机制来抑制胃溃疡炎症反应、氧化应激，从而减轻组织损伤［5-7］，有潜力开发成治疗胃溃疡或胃部疾病的新药［8］。研究表明，吴茱萸碱在胃部有一定吸收，适合制成胃滞留给药制剂［9］，但尚未见该成分首关效应的报道。

胃滞留给药系统是指口服制剂可长时间滞留于胃部，从而实现定位释药，可减少药物损失，有助于提高胃部疾病的治疗效果［10-13］。胃漂浮片通过保持自身密度小于胃内容物密度来实现漂浮，从而成为长时间缓慢释放药物的储库，可实现靶向、长效治疗，并且该制剂制备工艺简便，容易实现工业化生产，是药剂学研究热点之一。本实验制备吴茱萸碱胃漂浮片，并评价该制剂对家兔胃黏膜损伤的保护作用，以期为相关药物开发提供依据。

1 材料

1.1 仪器 安捷伦1200 型高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器（美国安捷伦公司）； PR124ZH型电子天平［奥豪斯仪器（上海） 有限公司］；TDP-5 型单冲压片机 （北京海富达科技有限公司）； RT612 型溶出仪（深圳锐拓科技有限公司）；SK8210HP 型台式超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）； 9240A 型鼓风干燥箱（上海百典仪器设备有限公司）； GZX-9070MBE 型电热鼓风干燥机（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）； BH-2型光学显微镜（日本Olympus 公司）。

1.2 试剂与药物 吴茱萸碱对照品 （批号110802-201925，纯度99.5%，中国食品药品检定研究院）； 吴茱萸碱原料药（批号200328，纯度97.0%，湖北帝柏化工有限公司）。西咪替丁胶囊（批号20220219，重庆科瑞制药有限公司）。羟丙甲基纤维素K4M （HPMC K4M，上海卡乐康包衣技术有限公司）； 碳酸氢钠（批号202006，上海虹光化工厂）； 十六醇（批号191210，西陇科学股份有限公司）； 硬脂酸镁（批号WS171008，河南毅硕生物科技有限公司）。

1.3 动物 健康新西兰家兔，雌雄各半，体质量2.0～2.5 kg，购自河南省实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK （豫） 2020-0001。

2 方法与结果

2.1 吴茱萸碱含量测定 采用HPLC 法。

2.1.1 色谱条件 Agilent SB-C18色谱柱（5 μm，200 mm×4.6 mm）； 流动相乙腈-0.1%磷酸（含2%四氢呋喃） （40 ∶60）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温35 ℃； 检测波长225 nm。

2.1.2 供试品溶液制备 取10 片胃漂浮片，研细，精密称取粉末0.3 g （含吴茱萸碱约10 mg），转移至50 mL 量瓶中，加入30 mL 乙腈超声处理10 min，流动相定容，摇匀后8 500 r/min 离心10 min，取上清液1 mL 至50 mL 量瓶中，流动相定容，即得。

2.1.3 线性关系考察 取吴茱萸碱对照品适量，乙腈制成质量浓度为1.0 mg/mL 的贮备液，密封，取适量，流动相稀释至0.05、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标 （Y） 进行回归，得方程为Y＝23.489 2X+0.136 5 （r＝0.999 9），在0.05 ～10.0 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.1.4 方法学考察 取1 片胃漂浮片，按“2.1.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得吴茱萸碱含量RSD 为1.30%，表明该方法重复性良好。取供试品溶液适量，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得吴茱萸碱含量RSD 为0.45%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。取低（0.05 μg/mL）、中（1.0 μg/mL）、高（10.0 μg/mL） 质量浓度对照品溶液适量，同一天内在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得吴茱萸碱含量 RSD 分别为 0.36%、0.22%，0.24%，表明该方法日内精密度良好； 同法连续测定6 d，每天1 次，测得吴茱萸碱含量RSD 分别为0.63%、0.47%、0.52%，表明该方法日间精密度良好。取10 片胃漂浮片，研细，精密称取9 份，每份约0.15 g （含吴茱萸碱约5 mg），分成3 组，分别加入“2.1.3” 项下贮备液2.5、5.0、7.5 mL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得吴茱萸碱平均加样回收率分别为101.08%、100.82%、99.40%，RSD 分别为1.04%、0.68%、0.79%。

2.2 释放度测定 采用2020 年版《中国药典》四部0931 通则第二法，设定释放介质为1 000 mL人工胃液（超声处理30 min 脱气），温度为（37±0.5）℃，转速为100 r/min，取样点为1、2、4、6、8、10、12 h，取样体积为3 mL，并补加3 mL空白介质，0.45 μm 微孔滤膜过滤，计算不同时间点累积释放度，绘制释药曲线。

2.3 固体分散体制备及溶解度、释放度测定 取2 g 吴茱萸碱原料药、10 g PVP K30，加入100 mL 无水乙醇，在50 ℃下搅拌3 h，减压旋蒸除去有机溶剂，即得，收集粉末，置于40 ℃真空干燥箱中过夜。

取16.4 mL 稀盐酸至1 000 mL 量瓶中，加800 mL纯化水、10 g 胃蛋白酶，超声溶解，调节pH 至1.3 左右，纯化水定容，即得人工胃液，采用饱和溶剂测得吴茱萸碱及其固体分散体溶解度分别为4.03、68.72 μg/mL，即后者增加了17.05倍。取吴茱萸碱、物理混合物（吴茱萸碱、PVP K30 用量比例1 ∶5）、吴茱萸碱固体分散体粉末适量，5 mL 人工胃液制成混悬液，置于透析袋（截留分子量35 000 Da） 中，扎紧，按“2.2” 项下方法测定累积溶出度，结果见图1，可知固体分散体能促进原料药溶出度。

图1 吴茱萸碱体外溶出曲线（n＝3）Fig.1 In vitro dissolution curves for evodiamine （n＝3）

2.4 胃漂浮片制备 采用粉末直接压片法［14-16］，固定吴茱萸碱用量10 mg/片 （固体分散体中约60 mg/片），取HPMC K15M、十六醇、碳酸氢钠、填充剂（乳糖） 适量，过100 目筛，通过等量递加法混匀，加入1%硬脂酸镁后再混匀，在单冲压片机上压制成直径为8 mm，片重约为0.3 g，即得，硬度控制在（45±5） N。

2.5 漂浮性能测定 设定介质为1 000 mL 人工胃液（超声处理30 min 脱气），温度为 （37 ±0.5）℃，转速为100 r/min，以胃漂浮片从接触介质到稳定漂浮在液面的时间为浮动滞后时间，从开始漂浮到下沉的时间为漂浮时间。

2.6 处方优化 采用Box-Behnken 响应面法。

课题组前期以浮动滞后时间、漂浮时间为评价指标，对HPMC K15M 用量、十六醇用量、碳酸氢钠用量进行筛选，发现三者分别在20% ～36%、4% ～10%、8% ～16% 时可满足浮动滞后时间小于60 s、漂浮时间大于12 h 的要求，但它们对胃漂浮片体外释药有较大影响。因此，本实验以HPMC K15M 用量（X1）、十六醇用量（X2）、碳酸氢钠用量（X3） 为影响因素，2、6、12 h 内累积释放度（Q2h、Q6h、Q12h） 的综合评分Q为评价指标，公式为Q＝|Q2h-25%|×100+|Q6h-55%|×100+|Q12h-90%|×100，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

对表2 数据进行二次多元回归拟合，得方程为Q＝3.80+7.13X1+2.54X2-12.79X3+3.07X1X2-6.23X1X3-4.50X2X3+7.35X21+9.87X22+13.77X23，方差分析见表3。由此可知，模型P＜0.01，具有高度显著性； 失拟度P＞0.05，R2＝0.961 8，AdjR2＝0.912 7，表明模型可用于处方优化，未知因素干扰很小； 因素X2、X3、X1X3、X21、X22、X23 均有显著或极显著影响（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

采用Design Expert V8.0.6 软件进行响应面分析，结果见图2。设置综合评分目标值为最小，得到最优处方为HPMC K15M 用量25.44%，十六醇用量7.03%，碳酸氢钠用量13.57%，综合评分为0.7 分，为了便于实际操作，将其调整为HPMC K15M 用量25.5%，十六醇用量7.0%，碳酸氢钠用量13.6%。

图2 各因素响应面图Fig.2 Response surface plots for various factors

2.7 验证试验 固定吴茱萸碱用量10 mg/片，HPMC K15M 用量25.5%，十六醇用量7.0%，碳酸氢钠用量13.6%，乳糖补充片重至0.3 g，混匀后加入1%硬脂酸镁，再次混匀后压制3 批样品，按“2.5” 项下方法测得平均浮动滞后时间为76 s，平均漂浮时间达12 h，12 h 内累积释放度均大于90% （图3），综合评分为1.6 分，可知该工艺重复性良好，模型精确可靠。再按2020 年版《中国药典》 四部通则测得胃漂浮片平均硬度为47 N，脆碎度检查显示片剂减失量为0.73%，重量差异为3.66%。

图3 吴茱萸碱体外释药曲线（n＝6）Fig.3 In vitro drug release curves for evodiamine （n＝6）

2.8 胃黏膜损伤保护作用研究

2.8.1 分组、给药与造模 家兔适应性饲养1 周后随机分为5 组，即正常组、模型组、吴茱萸碱胃漂浮片低剂量组（20 mg/kg）、吴茱萸碱胃漂浮片高剂量组（40 mg/kg）、西咪替丁组（20 mg/kg），每组6 只，雌雄兼具，其中正常组、模型组灌胃给予生理盐水，给药组灌胃给予相应药物，连续13 d，正常进食饮水，观察其活动、精神状态。给药13 d 后，各组家兔禁食不禁水，除正常组外灌胃给予5.0 mL 无水乙醇以建立急性胃黏膜损伤模型，1.5 h 后空气栓塞法处死，取出胃组织。

2.8.2 胃组织病理变化观察 生理盐水洗去家兔胃组织内容物，平铺于玻璃板上，棉球清理胃黏膜表面血丝，切取约1 cm×1 cm，置于10%中性福尔马林溶液中24 h，乙醇脱水后二甲苯透明，石蜡包埋，HE 染色，在显微镜下观察其病理变化，结果见图4。由此可知，正常组黏液层结构未缺失，腺体顶部圆润完好，组织细胞排列致密，未见炎性细胞浸润、水肿、充血等（图4A）； 模型组黏液层消失，受损严重，组织细胞排列紊乱（图4B）； 吴茱萸碱胃漂浮片低剂量组受损情况明显低于模型组，组织细胞排列相对致密，腺体顶部仍圆润完好，但有出血现象，胃黏膜缺失（图4C）； 吴茱萸碱胃漂浮片高剂量组、西咪替丁组无出血现象，黏液层仍清晰可见，但部分区域变薄，腺体结构完整，排列整齐（图4D～4E）。

图4 各组家兔胃组织病理变化（×200）Fig.4 Pathological changes of rabbit gastric tissue in various groups （×200）

2.8.3 行为特征观察 正常组家兔饮食正常，行动灵活，精神状态良好； 模型组家兔喜扎推，活动量明显减少，精神萎靡，反应迟钝，四肢有抖动现象； 吴茱萸碱胃漂浮片低剂量组家兔有1 只出现粪便溏稀现象，精神状态尚可； 吴茱萸碱胃漂浮片高剂量组、西咪替丁组家兔整体情况基本类似，精神状态、活动量均明显好于模型组。

2.8.4 溃疡抑制率测定 采用游标卡尺测量家兔胃内部溃疡长度、宽度，其中前者为溃疡部位的最大直径d1，后者为与最大直径垂直的最宽距离d2，计算溃疡面积S，公式为S＝π×d1/2×d2/2。再根据文献［17］ 报道计算胃黏膜损伤指数，溃疡面积1～12 mm2为1 分，13 ～25 mm2为2 分，26 ～37 mm2为3 分，38 ～50 mm2为4 分，大于51 mm2为5 分，穿孔为6 分。最后再计算胃溃疡抑制率，公式为抑制率＝ ［（模型组胃溃疡指数-给药组胃溃疡指数） /模型组胃溃疡指数］ ×100%，结果见表4，可知高剂量胃漂浮片可达到与西咪替丁类似的保护作用。

表4 溃疡抑制率测定结果（±s，n＝6）Tab.4 Results of ulcer inhibition rate determination （±s，n＝6）

表4 溃疡抑制率测定结果（±s，n＝6）Tab.4 Results of ulcer inhibition rate determination （±s，n＝6）

组别剂量/（mg·kg-1）胃黏膜损伤指数溃疡抑制率/%模型组—5.02±0.75—吴茱萸碱胃漂浮片低剂量组202.84±0.6243.43吴茱萸碱胃漂浮片高剂量组402.08±0.4058.56西咪替丁组201.89±0.3562.35

3 讨论

吴茱萸碱胃漂浮片与水相接触后体积发生膨胀，导致其密度下降，从而有助于实现漂浮，并且加入十六醇、碳酸氢钠的目的也是减小片剂密度［18］，提高漂浮性能。虽然十六醇用量在一定程度上会影响片剂释药情况［19］，但碳酸氢钠用量对释药的影响比十六醇用量大，这是因为前者用量合适时可有效消除片剂延迟释放、提高Q6h、Q12h，但用量过大时生成的CO2包裹在片剂表面，反而阻碍介质渗入内部。本实验进行吴茱萸碱胃漂浮片处方优化时，将Q2h、Q6h、Q12h转换为综合评分，期望Q2h释放度能达25%，防止出现迟释情况；Q6h释放度能在55% 左右，防止出现过释情况；Q12h释放度能达90%，防止出现释药不足情况，最终获得了漂浮性能良好、缓慢持续释药、累积释放度较高的处方。

按照家兔与成人（体质量按60 kg 计） 剂量之间的比例系数（3 ～4），结合本实验所制备的吴茱萸碱胃漂浮片剂量（10 mg/片，整片给药），最终确定家兔每日口服西咪替丁剂量为20 mg/kg［20］，并设置了低剂量组（20 mg/kg）、高剂量组（40 mg/kg） 进行比较。前期报道，吴茱萸碱给药剂量为2.68 g/kg 时动物未发生毒性反应，因此高剂量组灌胃40 mg/kg 时具有较高的安全性［21］。结果显示，吴茱萸碱胃漂浮片对家兔胃黏膜损伤具有一定预防性保护作用，但需加大给药剂量才能达到与西咪替丁相似的效果。对于茱萸和胃止痛胶囊、左金胶囊等临床上治疗胃病的常用中成药，吴茱萸碱、吴茱萸次碱每天口服总剂量在2.7 ～19.1 mg 之间［22-23］，故确定吴茱萸碱胃漂浮片含药量为10 mg/片。今后，需结合毒理学实验来确定吴茱萸碱胃漂浮片给药方案，并且其不同规格的相关情况也是研究重点。