杜义龙，高静云，刘文通，李艳荣，高 晗，沈 莹，潘海峰*

（1.河北省承德医学院/河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000； 2.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430； 3.承德御室金丹药业有限公司，河北 承德 068150）

山楂叶是蔷薇科植物山里红CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br或山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥叶，味酸，性平，归肝经，主治气滞血瘀、高脂血症、胸痹心痛、心悸健忘等［1］，主要化学成分为黄酮类、三萜类等［2］。现代研究表明，山楂叶对保护心血管系统，增加冠脉血流量、降血糖以及抗氧化、抗炎等均有一定作用［3-8］。

中药饮片标准汤剂是以中医理论为指导，临床应用为基础，参考现代提取方法并经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂［9］。《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》 规定，由于中药饮片药性、功效、质地、吸水性有较大差异，在制备标准汤剂时应对浸泡时间、加水量、煎煮时间等工艺参数进行优化［10］。目前，有关山楂叶标准汤剂制备工艺的研究较少，故本实验采用层次分析法结合响应面法对其进行优化，以期为该制剂功能成分研究提供科学依据和技术参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）； UV-2600 PROBE 型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）； KQ-700 型双频数控超声波清洗器（40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）； AG-245 型电子分析天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）； JA5003 型上皿天平（千分之一，天津天马衡基仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 芦丁（批号181227）、牡荆素葡萄糖苷（批号20042350）、牡荆素鼠李糖苷（批号18060103）、金丝桃苷（批号19103001）、异槲皮素（批号18062702） 对照品均购于成都普菲德生物技术有限公司（纯度＞98%）。山楂叶（产地河北省承德市隆化县） 购于市场，经全国老中医药专家（传统鉴定） 学术经验继承人孙宝惠主任药师鉴定蔷薇科山楂属植物山楂CrataeguspinnatifidaBunge 的叶。乙腈、甲酸、甲醇为色谱纯，购于美国Thermo Fisher Scientific 公司； 其他试剂均为分析纯； 水为纯净水，购于天津娃哈哈饮料有限公司。

2 方法与结果

2.1 出膏率测定 将山楂叶水煎液减压浓缩至250 mL，精密量取10 mL 至恒重升温干燥皿中，70 ℃水浴蒸干（约3 h），置于60 ℃烘箱中干燥5 h，称定质量，计算出膏率［11］，公式为出膏率＝ ［25× （m2-m1） /M］ ×100%，其中m1为蒸发前升温干燥皿质量，m2为烘干至恒重后升温干燥皿质量，M为山楂叶质量。

2.2 总黄酮提取率测定

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取120 ℃下干燥至恒重的芦丁对照品15.58 mg，转移至50 mL 量瓶中，加60%甲醇超声处理至完全溶解，定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 将山楂叶水煎液减压浓缩至250 mL，精密量取5 mL，转移至50 mL 量瓶中，加60%甲醇混匀并定容至刻度，过0.45 μm 微孔滤膜，精密量取续滤液10 mL，转移至25 mL 量瓶中，60%甲醇定容至刻度，即得。

尸解的结果让所有人惊呆了：那把刀无比精确地洞穿了他的心脏，他却多活了三天，而且可以做到不被任何人察觉。唯一可能的解释是因为创口太小，使得被切断的心肌依原样贴在一起，维持了三天的供血。这是医学史上罕见的奇迹。医学会议上，有人说要称为大西洋的奇迹，有人建议以死者的名字命名，还有人说要叫大神迹……“够了。”那是一位坐在首席的老医生，须发俱白，皱纹里满是人生的智慧，此刻一声大喝，然后一字一顿地说：“这个奇迹的名字，叫父爱。”

2.2.3 线性关系考察 按照文献［12］ 报道，以总黄酮质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A） 进行回归，得方程为A＝0.012 6X-0.021 4 （r＝0.999 2），在12.464～74.784 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.2.4 测定方法 按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，取1 mL 至25 mL 量瓶中，按“2.2.3” 项下方法测定吸光度，计算提取率，公式为提取率＝ （C×15.625/M） ×100%，其中C为总黄酮质量浓度，M为山楂叶质量。

2.3 各成分总提取率测定 采用HPLC 法。

2.3.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相（乙腈-四氢呋喃，12 ∶1）（A） -0.3%甲酸（B），梯度洗脱（0～15 min，8% ～12%A；15～25 min，12% ～16% A； 25 ～37.5 min，16% ～15% A；37.5～45 min，15% ～20% A； 45 ～50 min，20% ～34% A；50～55 min，34% ～100%A）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长350 nm； 进样量10 μL。色谱图见图1。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素对照品适量，60% 甲醇制成质量浓度分别为204.0、300.0、131.82、61.98 μg/mL的贮备液，精密吸取适量，60%甲醇依次稀释至2、4、8、16、32、64 倍，即得。

2.3.3 供试品溶液制备及测定方法 将山楂叶水煎液减压浓缩至250 mL，精密量取5 mL，转移至50 mL 量瓶中，加60%甲醇混匀并定容至刻度，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，计算提取率，公式为提取率＝ ［C1×A2/ （4×A1×M）］ ×100%，其中C1为对照品质量浓度，A1为对照品峰面积，A2为供试品峰面积，M为山楂叶质量。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取“2.3.2” 项下对照品溶液10 μL，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.3.6 重复性试验 取同一批标准汤剂，按“2.3.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，测得牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素含量分别为0.50%、0.47%、1.45%、0.74%，表明该方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，测得牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素峰面积RSD 分别为0.91%、0.70%、2.28%、2.00%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密吸取各成分含量已知的标准汤剂浓缩液2.5 mL，共6 份，按100% 水平精密加入对照品溶液，按 “2.3.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素平均加样回收率分别为 102.72%、95.70%、98.61%、97.19%，RSD 分别为0.51%、0.10%、0.64%、0.47%。

2.4 层次分析法

2.4.1 判断矩阵构建 总黄酮是山楂叶主要活性成分，2020 年版《中国药典》 也将该成分含量作为山楂叶及其提取物的主要质量控制指标［1，12］，故本实验将其提取率作为第一重要测定指标； 牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷在山楂叶中的含量较高，2020 年版《中国药典》 也将两者分别作为山楂叶提取物、药材的质量控制指标［1，12］，故本实验将其提取率作为第二重要测定指标； 牡荆素葡萄糖苷、异槲皮素在山楂叶中的含量也较高，药理活性明确，在相关质量控制研究中常作为定性定量指标［13-17］，但尚未被2020 年版《中国药典》 收录，故本实验将两者提取率作为第三重要测定指标； 出膏率是用于判断制备工艺稳定性的重要指标，但不能反映有效成分质量信息，故本实验将其作为第四重要测定指标。按总黄酮提取率＞牡荆素鼠李糖苷提取率＝金丝桃苷提取率＞牡荆素葡萄糖苷提取率＝异槲皮素提取率＞出膏率的顺序，根据层次分析法理论判断矩阵1 ～9 标度法［18］，对同一层次内其相对重要程度进行打分，其中总黄酮作为山楂叶主要活性成分，其提取率相对于出膏率强烈重要，故标为7； 牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷提取率相对于出膏率明显重要，故标为5； 牡荆素葡萄糖苷、异槲皮素提取率相对于出膏率稍重要，故标为3，以此类推，构建判断矩阵，见表2。

表2 指标成对比较的优先判断矩阵

2.4.2 权重计算 先构建几何平均判断矩阵M，依据公式（1） 计算初始权重系数Wj＇，其中ajn表示表示第j（j＝1，2，…，n） 个指标因素对第n（n＝1，2，…，j） 个指标因素的比较结果，再依据公式 （2） 计算归一化权重系数WjS，得到6 个指标权重系数分别为0.041 67、0.291 67、0.208 33、0.208 33、0.125、0.125。

2.4.3 一致性检验 对矩阵进行一致性检验，计算一致性指标（CI）、一致性比例（CR）。根据公式（3） ～ （5） 测得CI＝0，CR＝0，均小于0.1，表明该矩阵一致性良好。

2.4.4 综合评分 通过层次分析法对标准汤剂各指标权重进行量化，计算综合评分Y，公式为Y＝总黄酮提取率×0.291 67+鼠李糖苷提取率×0.208 33+金丝桃苷提取率×0.208 33+葡萄糖苷提取率×0.125+异槲皮素提取率×0.125+出膏率×0.041 67。

2.5 单因素试验

2.5.1 浸泡时间 前期报道，充分浸泡可使中药饮片表面湿润变软，即植物细胞吸水膨胀，吸水率越高，膨胀越充分，植物细胞内活性成分在煎煮过程中更易溶出［19］，公式为吸水率＝ （V药材吸水量/V加水总量） ×100%。取山楂叶100 g，加14 倍量水，分别考察浸泡时间10、20、30、40、50 min对吸水率的影响，发现各时间点吸水率分别为0.161%、0.196%、0.200%、0.204%、0.204%，即随着浸泡时间延长吸水率升高，而浸泡40 min 后无变化，故确定浸泡时间为40 min。

2.5.2 加水量 取山楂叶100 g，浸泡40 min，根据2021年发布的 《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》［10］（标准汤剂每剂药一般煎煮2 次，加水量一般以浸过药面2～5 cm 为宜），药材煎煮2 次，一煎30 min，二煎20 min，趁热过滤，合并2 次滤液，按“2.3.3” 项下方法制备供试品溶液，分别考察加水量（10+8）、（12+10）、（14+12）、（16+14）、（18+16） 倍对综合评分的影响，发现不同加水量下综合评分分别为3.140、3.532、3.817、3.820、3.789 分，即在一煎加14 倍量水、二煎加12 倍量水时综合评分趋于平缓，可能已接近最大溶解量，故确定加水量为一煎14 倍，二煎12 倍。

2.5.3 煎煮时间 取山楂叶100 g，浸泡40 min，加水量为一煎14 倍，二煎12 倍，趁热过滤，合并2 次煎煮液，按“2.3.3” 项下方法制备供试品溶液，根据2021 年发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》［10］（煎煮时间为20～60 min，并且第二煎时间可适当缩短），考察煎煮时间（20+20）、（30+20）、（40+30）、（50+40）、（60+50）min 对综合评分的影响，发现不同煎煮时间下综合评分分别为3.526、3.670、3.854、3.917、3.954 分，即煎煮（50+40） min 后趋于平缓，故确定煎煮时间为一煎50 min，二煎40 min。

2.6 Box-Behnken 响应面法 在单因素试验基础上，选择浸泡时间（A）、加水量（B）、煎煮时间（C） 作为影响因素，总黄酮、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、牡荆素葡萄糖苷、异槲皮素提取率及出膏率的综合评分（Y） 作为评价指标，采用Design-Expert 12.0 软件优化制备工艺，因素水平见表3，结果见表4。

表3 因素水平

表4 试验设计与结果

采用上述软件对表4 数据进行多元回归拟合，得方程为Y＝3.82+0.001 3A+0.293 8B-0.047 5C-0.025AB+0.022 5AC+0.142 5BC+0.016A2-0.139B2-0.081 5C2，方差分析见表5。由此可知，模型F＝33.34，P＜0.000 1，具有高度显著性； 失拟项F＝2.90，P＝0.165 2＞0.05，表明结果受未知因素的干扰较小，残差由随机误差引起； 决定系数R2＝0.977 2，校正决定系数，变异系数CV为1.48%，表明模型置信度较高，可用于预测分析； 因素B、C、BC、B2、C2有显著或极显著影响（P＜0.05，P＜0.01）； 各因素影响程度依次为B＞C＞A。

表5 方差分析

响应面分析见图2 ～4。最终确定，最优工艺为浸泡时间30 min，一煎加16 倍量水煎煮54.44 min，二煎加14 倍量水煎煮44.44 min，综合评分为4.029 分，根据实际操作的可行性，将其修正为浸泡时间30 min，一煎加16 倍量水煎煮55 min，二煎加14 倍量水煎煮45 min。按上述优化工艺进行3 批验证试验，测得综合评分分别为4.07、4.09、4.05 分，平均4.07 分，RSD 为0.49%，与预测值4.029 分接近（相对偏差为1.01%），表明该工艺稳定、准确、可靠。

图2 浸泡时间、加水量对综合评分的影响

图3 浸泡时间、煎煮时间对综合评分的影响

图4 加水量、煎煮时间对综合评分的影响

3 讨论与结论

响应面法结果显示，浸泡时间30、40、50 min 对山楂叶标准汤剂制备工艺无明显影响，结合单因素试验推测，可能是由于浸泡30 min 时药材吸水率为0.196%，已接近最大值0.204%，即植物细胞已达到充分溶胀，故从降低制备成本、节约时间、提高效率的角度出发，确定最优浸泡时间为30 min。

2020 年版《中国药典》 项下山楂叶成分检测指标仅有总黄酮、金丝桃苷含量，但中药为多组分的复杂体系，仅测定这2 种成分含量难以全面评价该部位及其相关制剂质量。山楂叶主要有效成分为黄酮，包括牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、牡荆素葡萄糖苷、异槲皮素等，具有抗动脉粥样硬化、抗氧化、降血糖等作用［20-23］，本实验采用层次分析法结合响应面法优化其标准汤剂制备工艺，对比《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》［10］规定，可使结果更科学化，并验证了该工艺的合理性。