周 群，高思琦，张霖璋，张 华，刘 伟，刘 平*，陈佳美*

（1.上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海市中医临床重点实验室，上海 201203； 2.上海中医药大学交叉科学研究院，上海市中医药化学生物学前沿基地，上海 201203）

肝纤维化是多种慢性肝脏疾病的共同病理过程，慢性肝炎病毒感染、酒精和胆汁淤积等长期损害均可导致肝纤维化的进展，最终发展为肝硬化和肝癌［1］。胆汁淤积性肝纤维化是由于肝细胞或毛细胆管中胆汁流合成、分泌和排泄异常，肝内或肝外胆管阻塞，诱发持续性胆汁淤积所致［2］。目前用于治疗胆汁淤积性肝纤维化的药物为熊去氧胆酸和奥贝胆酸，但均面临部分患者疗效不佳和较高的不良事件发生率等问题［3-4］。因此，探求胆汁淤积性肝纤维化的有效治疗手段，阻止疾病的进程，是当前研究需攻克的主要目标和方向。

中医药以其多靶点、多途径、多层次的药理作用，在肝纤维化治疗领域展现出明显的优势。课题组前期研究发现，黄芪汤及其有效组分黄芪总苷具有良好的抗肝纤维化作用，可通过抑制肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC） 活化［5］、抑制转化生长因子β （transforming growth factor β，TGF-β） 和Notch 信号通路的活化［6-7］，改善胆管结扎和二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化大鼠血清肝功能异常变化和肝纤维化程度［8-10］。本研究通过建立外源性和内源性的胆汁淤积性肝纤维化小鼠模型——化合物3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氢-2，4，6-三甲基吡啶 （3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydro-2，4，6-collidine，DDC） 喂养和多药耐药蛋白2 （multidrug resistance protein 2，Mdr2） 基因敲除，观察黄芪总苷对胆汁淤积性肝纤维化的干预作用，并探索其部分作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性C57BL/6 小鼠，体质量（22±2） g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （沪） 2017-0011］； SPF 级雄性Mdr2-/-小鼠，体质量（22±2）g，购自赛业模式生物研究中心（太仓） 有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （苏） 2018-0003］。所有小鼠均饲养于上海中医药大学动物实验中心，恒温恒湿，昼夜节律，环境温度22 ～24 ℃，相对湿度30% ～60%，自由进食饮水。动物实验经上海中医药大学实验动物伦理委员会批准 （伦理号PZSHUTCM200731007）。

1.2 药物与试剂 DDC （美国Sigma-Aldrich 公司，货号137030）； 黄芪总苷（本课题组采用大孔树脂柱层析法制备，乙醇回流提取2 次，浓缩干燥所得）； 奥贝胆酸（大连美仑生物技术有限公司，货号 MB6084）。丙氨酸氨基转移酶 （alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆红素 （total bilirubin，TBIL）、直接胆红素 （direct bilirubin，DBIL）、间接胆红素（indirect bilirubin，IBIL） 生化检测试剂盒（美国贝克曼库尔特公司，批号AUZ7214、AUZ7031、AUZ7121、AUZ7101、AUZ7103、AUZ7105）； 总胆汁酸生化检测试剂盒（上海执诚生物科技有限公司，批号ZCFEBT009）； 苏木素-伊红染色试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号D006-1-4）； 免疫组化试剂盒［基因科技（上海） 有限公司，货号GK500705］； 总RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Green Real Time PCR Master Mix （日本TOYOBO 公司，货号NPK-201、FSQ-301、QPK-201）； RIPA 裂解液、蛋白蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、30% 丙烯酰胺溶液、Tris-HCl 溶液 （pH 6.8）、Tris-HCl 溶液（pH 8.8）、BSA、一抗稀释液、10%SDS、过硫酸铵（APS）、5×蛋白上样缓冲液（上海碧云天生物技术有限公司，货号P0013B、P1045、P0010、ST003、ST768、ST789、ST023、P0256、ST628、ST005、P0015）； 预染蛋白Marker（美国Thermo Fisher Scientific 公司，货号26616）；GAPDH 抗体（美国Proteintech 公司，货号60004-1-Ig）； α-平滑肌肌动蛋白 （alpha smooth muscle actin，α-SMA）、沉默信息调节因子1 （silent information regulator 1，SIRT1） 抗体（英国Abcam公司，货号 Ab124964、Ab110304）； I 型胶原（collagen type I alpha 1，Col1a1） 抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号A1352）。聚合酶链式反应引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 仪器 Synchron DXC800 型全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司）； JXFSTPRP-24 型全自动快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；F200 PRO 型酶标仪（瑞士Tecan 公司）； Vii7 型PCR 仪（美国ABI 公司）； 041BR127719 型电泳仪及转膜仪、Thermal Cyxler 型cDNA 逆转录仪（美国Bio-Rad 公司）； Odyssey CLX 型双色红外荧光成像系统（美国LI-COR 公司）； ASP300 型封闭式组织脱水机、EG1160 型组织包埋机、RM2035 型石蜡切片机、HI1220 型组织病理学用烘片仪、SCN400 型数据切片扫描机（德国Leica 公司）。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 8 周龄雄性C57BL/6 小鼠适应性饲养后，按体质量随机分成对照组、模型组、黄芪总苷112 mg/kg 组、黄芪总苷56 mg/kg 组和奥贝胆酸（10 mg/kg） 组，每组8 只。对照组给予常规饲料喂养，其余组给予0.1% DDC 喂养8 周，第5周起各组按相应给药剂量每天灌胃给药1 次，连续4周，对照组和模型组灌胃给予等体积蒸馏水。

8 周龄雄性Mdr2-/-小鼠按体质量随机分成模型组、黄芪总苷56 mg/kg 组、黄芪总苷28 mg/kg组和奥贝胆酸（10 mg/kg） 组，以同窝雄性野生型为对照组，每组8 只。各组按相应给药剂量每天灌胃给药1 次，连续3 周，对照组和模型组灌胃给予等体积蒸馏水。

取材前12 h 小鼠禁食不禁水，取材当日以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，经腹主动脉采集血液，静置3 h，3 000 r/min 离心15 min （离心半径10 cm） 获取血清，并收集肝组织样本用于后续检测。

2.2 血清生化指标检测 血清生化指标由上海中医药大学附属曙光医院检验科协助检测，检测ALT、AST、ALP 活性及TBA、TBIL、DBIL、IBIL水平。

2.3 肝组织病理学染色及观察 取材当日留取肝脏大叶同一部位，于10%中性甲醛缓冲液中固定，封闭式组织脱水机自动脱水，组织包埋机石蜡包埋，切片，分别行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE） 染色和天狼猩红（sirus red，SR） 染色，封片后用数字切片扫描机自动扫描，观察肝细胞损伤、纤维化程度等。

2.4 免疫组化染色观察肝组织α-SMA 和Col1a1表达 肝组织石蜡切片充分脱蜡至水，微波抗原修复，滴加3%过氧化氢溶液室温避光孵育15 min 以消除内源性过氧化物酶，滴加10% 山羊血清封闭30 min 以清除非特异性背景染色，滴加一抗（α-SMA、Col1a1，稀释比例1 ∶1 000、1 ∶200） 4 ℃过夜，次日PBS 洗涤3 次，滴加二抗37 ℃孵育30 min，辣根过氧化物酶显色，苏木素染核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后用中性树胶封片，数字切片扫描机自动扫描，观察肝组织α-SMA 和Col1a1表达。

2.5 RT-qPCR 法检测肝组织α-SMA、Col1a1、Col4a1、TGF-β1 mRNA 表达 称取约30 mg 肝组织，提取总RNA 后测定其浓度，根据逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA，然后进行扩增反应。反应体系为5 μL SYBR PCR Master Mix、3.6 μL DEPC、0.2 μL 正向引物、0.2 μL 反向引物； 反应条件为50 ℃2 min，95 ℃1 min、95 ℃变性15 s、60 ℃延伸退火1 min，扩增45 个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA 相对表达量。

2.6 Western blot 法检测肝组织α-SMA、SIRT1 蛋白表达 称取约30 mg 肝组织，加入600 μL 含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液，匀浆后离心取上清液，即得总蛋白，根据BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书测定总蛋白浓度，制备上样缓冲液。蛋白样本经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法转移至膜，5% BSA 封闭后孵育一抗α-SMA （1 ∶1 000）、SIRT1 （1 ∶ 1 000）、GAPDH （1 ∶5 000），洗膜后孵育二抗，ECL 法显影，使用Odyssey 红外荧光成像系统扫膜，获取蛋白条带图片，通过Image J 软件分析条带的灰度值。

2.7 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件进行处理，计量资料以（±s） 表示，若数据呈正态分布且方差齐性，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用最小显著差数法LSD-t检验； 若数据呈非正态分布或方差不齐，则采用非参数检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 黄芪总苷对胆汁淤积性肝纤维化小鼠肝质量和肝脏系数的影响 与同期对照组比较，DDC 模型组小鼠肝质量与肝脏系数均升高（P＜0.01）； 与DDC 模型组比较，黄芪总苷56 mg/kg 和奥贝胆酸组小鼠肝质量与肝脏系数均降低（P＜0.05），见表2。

表2 黄芪总苷对DDC 模型小鼠肝质量和肝脏系数的影响（±s，n＝8）Tab.2 Effects of astragalosides on liver weight and liver index level in DDC-treated mouse models （±s，n＝8）

表2 黄芪总苷对DDC 模型小鼠肝质量和肝脏系数的影响（±s，n＝8）Tab.2 Effects of astragalosides on liver weight and liver index level in DDC-treated mouse models （±s，n＝8）

注： 与同期对照组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05。

组别剂量/（mg·kg-1）肝质量/g肝脏系数/%对照组—1.10±0.044.38±0.28模型组—3.08±0.23** 12.90±0.62**黄芪总苷组1122.90±0.1612.07±0.29 562.72±0.54＃11.52±1.28＃奥贝胆酸组102.75±0.19＃11.77±0.45＃

与同期对照组比较，Mdr2-/-模型组小鼠肝质量与肝脏系数均升高（P＜0.01）； 与Mdr2-/-模型组比较，黄芪总苷56 mg/kg 组小鼠肝质量与肝脏系数均降低（P＜0.01），黄芪总苷28 mg/kg 组小鼠肝质量降低（P＜0.05），见表3。

表3 黄芪总苷对Mdr2-/-模型小鼠肝质量和肝脏系数的影响（±s，n＝8）Tab.3 Effects of astragalosides on liver weight and liver index level in Mdr2-/- mouse models （±s，n＝8）

表3 黄芪总苷对Mdr2-/-模型小鼠肝质量和肝脏系数的影响（±s，n＝8）Tab.3 Effects of astragalosides on liver weight and liver index level in Mdr2-/- mouse models （±s，n＝8）

注： 与同期对照组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别剂量/（mg·kg-1）肝质量/g肝脏系数/%对照组—1.01±0.084.19±0.24模型组—1.61±0.07**6.46±0.35**黄芪总苷组561.44±0.06＃＃5.69±0.31＃＃281.52±0.06＃6.13±0.25奥贝胆酸组101.65±0.076.46±0.30

3.2 黄芪总苷对胆汁淤积性肝纤维化小鼠血清肝功能的影响 与同期对照组比较，DDC 模型组小鼠血清 ALT、AST、ALP 活性和 TBA、TBIL、DBIL、IBIL 水平均升高（P＜0.01）； 与DDC 模型组比较，黄芪总苷56 mg/kg 组和奥贝胆酸组小鼠血清ALT、AST、ALP 活性和TBA、TBIL、DBIL、IBIL 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），黄芪总苷112 mg/kg 组小鼠血清ALP 活性和TBA、TBIL、DBIL、IBIL 水平降低（P＜0.05），见表4～5。

表4 黄芪总苷对DDC 模型小鼠血清ALT、AST、ALP 活性的影响（U/L，±s，n＝8）Tab.4 Effects of astragalosides on serum ALT，AST and ALP activities in DDC-treated mouse models （U/L，±s，n＝8）

表4 黄芪总苷对DDC 模型小鼠血清ALT、AST、ALP 活性的影响（U/L，±s，n＝8）Tab.4 Effects of astragalosides on serum ALT，AST and ALP activities in DDC-treated mouse models （U/L，±s，n＝8）

注： 与同期对照组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别剂量/（mg·kg-1）ALTASTALP对照组—31.57±6.50136.57±24.4935.43±6.37模型组—966.33±89.48**541.83±50.21**246.17±65.99**黄芪总苷组112870.00±104.21484.67±68.47178.00±19.05＃56807.67±74.30＃＃440.17±78.92＃162.17±9.20＃奥贝胆酸组10685.67±76.97＃＃371.83±40.08＃＃153.00±18.12＃＃

表5 黄芪总苷对DDC 模型小鼠血清TBA、TBIL、DBIL 和IBIL 水平的影响（μmol/L，±s，n＝8）Tab.5 Effects of astragalosides on serum TBA，TBIL，DBIL and IBIL levels in DDC-treated mouse models （μmol/L，±s，n＝8）

表5 黄芪总苷对DDC 模型小鼠血清TBA、TBIL、DBIL 和IBIL 水平的影响（μmol/L，±s，n＝8）Tab.5 Effects of astragalosides on serum TBA，TBIL，DBIL and IBIL levels in DDC-treated mouse models （μmol/L，±s，n＝8）

注： 与同期对照组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别剂量/（mg·kg-1）TBATBILDBILIBIL对照组—1.08±0.151.05±0.170.23±0.050.83±0.21模型组—119.58±51.19**50.03±37.05**32.77±24.71**17.30±12.37**黄芪总苷组11218.28±3.92＃＃3.26±3.43＃＃1.29±1.80＃＃1.71±1.49＃＃5616.18±2.71＃＃1.98±0.74＃＃0.85±0.35＃＃1.13±0.42＃＃奥贝胆酸组1012.82±9.21＃＃1.84±0.73＃＃0.81±0.84＃＃1.15±0.33＃＃

与同期对照组比较，Mdr2-/-模型组小鼠血清ALT、AST、ALP 活性和TBA、TBIL、DBIL 和IBIL水平均升高（P＜0.01）； 与Mdr2-/-模型组比较，黄芪总苷56 mg/kg 组小鼠血清ALT、AST、ALP活性和IBIL 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），黄芪总苷28 mg/kg 组小鼠血清ALP 活性降低 （P＜0.05），奥贝胆酸组小鼠血清ALP 活性和TBA 水平降低（P＜0.05），见表6～7。

表6 黄芪总苷对Mdr2-/-模型小鼠血清ALT、AST 和ALP 活性的影响（U/L，±s，n＝8）Tab.6 Effects of astragalosides on serum ALT，AST and ALP activities in Mdr2-/- mouse models （U/L，±s，n＝8）

表6 黄芪总苷对Mdr2-/-模型小鼠血清ALT、AST 和ALP 活性的影响（U/L，±s，n＝8）Tab.6 Effects of astragalosides on serum ALT，AST and ALP activities in Mdr2-/- mouse models （U/L，±s，n＝8）

注： 与同期对照组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别剂量/（mg·kg-1）ALTASTALP对照组—40.71±10.37127.86±21.21104.57±11.01模型组—279.17±125.75**429.00±242.21**171.00±21.14**黄芪总苷组56165.43±58.06＃217.57±83.37＃126.86±16.48＃＃28193.14±30.81271.00±24.72141.00±18.08＃奥贝胆酸组10212.33±94.93293.50±62.44139.67±43.33＃

表7 黄芪总苷对Mdr2-/-模型小鼠血清TBA、TBIL、DBIL 和IBIL 水平的影响（μmol/L，±s，n＝8）Tab.7 Effects of astragalosides on serum TBA，TBIL，DBIL and IBIL levels in Mdr2-/- mouse models （μmol/L，±s，n＝8）

表7 黄芪总苷对Mdr2-/-模型小鼠血清TBA、TBIL、DBIL 和IBIL 水平的影响（μmol/L，±s，n＝8）Tab.7 Effects of astragalosides on serum TBA，TBIL，DBIL and IBIL levels in Mdr2-/- mouse models （μmol/L，±s，n＝8）

注： 与同期对照组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05。

组别剂量/（mg·kg-1）TBATBILDBILIBIL对照组—0.87±0.422.30±0.180.29±0.072.01±0.13模型组—19.37±13.27**4.50±1.63**1.05±0.81**3.47±0.82**黄芪总苷组569.85±4.043.40±0.770.79±0.272.51±0.62＃2813.08±3.273.93±0.510.96±0.353.09±0.36奥贝胆酸组105.11±2.45＃3.44±1.140.72±0.272.66±0.81

3.3 黄芪总苷对胆汁淤积性肝纤维化小鼠肝组织病理学变化及胶原沉积的影响 肝组织HE 染色可见同期对照组小鼠肝组织小叶结构清晰，汇管区及中央静脉无扩大，未见炎性细胞浸润； DDC 模型组可见肝组织结构紊乱，含有广泛的卟啉沉积物，大量胆管上皮细胞异常增生，节段性胆管堵塞，炎性细胞浸润； 黄芪总苷各剂量组和奥贝胆酸组病理变化均有不同程度减轻，肝脏损伤明显改善。SR染色结果显示，与同期对照组比较，DDC 模型组可见汇管区胶原纤维大量沉积，纤维间隔明显，阳性着色较深，肝组织胶原阳性面积和HYP 水平均增加（P＜0.01）； 与DDC 模型组比较，黄芪总苷各剂量组和奥贝胆酸组阳性染色均有不同程度减少，胶原纤维变细，肝组织胶原阳性面积和HYP水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），见图1。

图1 黄芪总苷对DDC 模型小鼠肝组织病理学变化及胶原沉积的影响（±s，n＝8）Fig.1 Effects of astragalosides on hepatic pathological changes and collagen deposition in DDC-treated mouse models （±s，n＝8）

肝组织HE 染色可见同期对照组小鼠肝组织小叶结构清晰，汇管区及中央静脉无扩大，未见炎性细胞浸润； Mdr2-/-模型组肝组织可见大量炎性细胞浸润，胆管上皮细胞异常增生，胆管周围呈纤维化改变； 黄芪总苷各剂量组和奥贝胆酸组病理变化均有不同程度减轻，肝脏损伤明显改善。SR 染色结果显示，与同期对照组比较，Mdr2-/-模型组可见汇管区胶原纤维大量沉积，纤维间隔明显，形成假小叶，肝组织胶原阳性面积和HYP 水平均增加（P＜0.01）； 与Mdr2-/-模型组比较，黄芪总苷各剂量组和奥贝胆酸组阳性染色均有不同程度减少，胶原纤维变细，黄芪总苷56 mg/kg 组胶原阳性面积和肝组织HYP 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），奥贝胆酸组肝组织HYP 水平降低（P＜0.05）。见图2。

3.4 黄芪总苷对胆汁淤积性肝纤维化小鼠肝组织纤维化相关指标的影响 免疫组化染色结果显示，与同期对照组比较，DDC 模型组小鼠肝组织α-SMA 和Col1a1 免疫组化阳性表达减少，α-SMA 蛋白及mRNA 表达、Col1a1 和Col4a1 mRNA 表达均升高（P＜0.01）； 与DDC 模型组比较，黄芪总苷各剂量组和奥贝胆酸组小鼠肝组织α-SMA 和Col1a1 免疫组化阳性表达增加，α-SMA、Col1a1 和Col4a1 mRNA 表达均降低（P＜0.01），黄芪总苷56 mg/kg 组和奥贝胆酸组小鼠肝组织α-SMA 蛋白降低（P＜0.01），见图3。

图3 黄芪总苷对DDC 模型小鼠肝组织纤维化相关指标的影响（×200，±s，n＝8）Fig.3 Effects of astragalosides on hepatic fibrosis related indicators in DDC-treated mouse models （×200，±s，n＝8）

免疫组化染色结果显示，与同期对照组比较，Mdr2-/-模型组小鼠肝组织α-SMA 和Col1a1 免疫组化阳性表达、α-SMA 蛋白及mRNA 表达、Col1a1和Col4a1 mRNA 表达均升高 （P＜0.01）； 与Mdr2-/-模型组比较，黄芪总苷各剂量组和奥贝胆酸组小鼠肝组织α-SMA 和Col1a1 免疫组化阳性表达均减少，α-SMA、Col4a1 mRNA 表达均降低（P＜0.05，P＜0.01），黄芪总苷56 mg/kg 组小鼠肝组织Col1a1 mRNA 表达降低（P＜0.05），黄芪总苷56 mg/kg 组和奥贝胆酸组小鼠肝组织α-SMA 蛋白表达降低（P＜0.01），见图4。

图4 黄芪总苷对Mdr2-/-模型小鼠肝组织纤维化相关指标的影响（×200，±s，n＝8）Fig.4 Effects of astragalosides on hepatic fibrosis related indicators in Mdr2-/- mouse models （×200，±s，n＝8）

3.5 黄芪总苷对胆汁淤积性肝纤维化小鼠肝组织SIRT1 蛋白和TGF-β1 mRNA 表达的影响 与同期对照组比较，DDC 模型组小鼠肝组织SIRT1 蛋白表达降低（P＜0.01），TGF-β1 mRNA 表达升高（P＜0.01）； 与DDC 模型组比较，黄芪总苷56 mg/kg 组和奥贝胆酸组小鼠肝组织SIRT1 蛋白表达升高（P＜0.01），TGF-β1 mRNA 表达降低（P＜0.01），黄芪总苷112 mg/kg 组小鼠肝组织TGF-β1 mRNA表达降低（P＜0.01），见图5。

图5 黄芪总苷对DDC 模型小鼠肝组织SIRT1 蛋白和TGF-β1 mRNA 表达的影响（±s，n＝8）Fig.5 Effects of astragalosides on hepatic expressions of SIRT1 protein and TGF-β1 mRNA in DDCtreated mouse models （±s，n＝8）

与同期对照组比较，Mdr2-/-模型组小鼠肝组织SIRT1 蛋白表达降低（P＜0.01），TGF-β1 mRNA表达升高（P＜0.01）； 与Mdr2-/-模型组比较，黄芪总苷56 mg/kg 组和奥贝胆酸组小鼠肝组织SIRT1 蛋白表达升高 （P＜0.01），TGF-β1 mRNA表达降低（P＜0.01），黄芪总苷28 mg/kg 组小鼠肝组织TGF-β1 mRNA 表达降低（P＜0.01），见图6。

图6 黄芪总苷对Mdr2-/-模型小鼠肝组织SIRT1 蛋白和TGF-β1 mRNA 表达的影响（±s，n＝8）Fig.6 Effects of astragalosides on hepatic expressions of SIRT1 protein and TGF-β1 mRNA in Mdr2-/-mouse models （±s，n＝8）

4 讨论

黄芪总苷是中药黄芪的重要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、免疫调节及多器官保护等多种药理作用［11］。课题组前期研究表明，黄芪总苷可减轻胆管结扎、二甲基亚硝胺或四氯化碳诱导的肝纤维化，其作用机制与TGF-β1 和Notch信号通路有关［6-7，12］，其中160 mg/kg 黄芪总苷具有显著疗效。基于此，通过实验动物间的药物等效剂量换算得到本研究DDC 模型小鼠给药剂量为112 mg/kg，并设置56 mg/kg 的剂量以探索量效关系，结果提示56 mg/kg 黄芪总苷对DDC 模型小鼠的疗效更佳。为了进一步证明56 mg/kg 黄芪总苷是否是抗胆汁淤积性肝纤维化的最佳剂量，在Mdr2-/-模型中设置了56、28 mg/kg 2 个剂量，结果显示在Mdr2-/-模型小鼠中56 mg/kg 黄芪总苷同样具有更显著的药效。以上结果提示56 mg/kg 黄芪总苷具有显著的抗小鼠胆汁淤积性肝纤维化作用。

SIRT1 是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的组蛋白去乙酰化酶，具有高度保守性，参与调节广泛的生物学功能如转录、细胞周期、DNA 损伤修复、代谢、细胞凋亡和自噬［13］。近年来，SIRT1 在胆汁淤积性肝纤维化中的作用受到重视，认为其在HSC 活化和肝纤维化的过程中起着关键作用［14］。在肝纤维化动物模型、患者肝脏和活化的HSC 中均可观察到SIRT1 表达的下调，而激活SIRT1 可阻断HSC 活化，抑制肌成纤维细胞的转分化［15］。SIRT1 可与TGF-β/Smad 信号通路上的Smad3 结合，使其去乙酰化并抑制TGF-β1 的转录活性，从而发挥抗纤维化作用［16］。体外研究也证实，用TGF-β1 刺激人肝星状细胞系LX-2 细胞可导致SIRT1 蛋白表达下调，其过表达可降低α-SMA 和Col1a1 的表达，促进活化的LX-2 凋亡和向静息态逆转［17］。本研究结果显示，与同期对照组比较，DDC 和Mdr2-/-模型小鼠肝组织中SIRT1 表达均被抑制，而黄芪总苷可改善这一异常表达，提示黄芪总苷可能通过上调SIRT1 表达发挥抗胆汁淤积性肝纤维化的作用。

小鼠喂养肝毒性化合物DDC 会导致胆管内卟啉栓塞、胆道梗阻，从而造成慢性胆汁淤积，诱发肝纤维化［18-19］。Mdr2-/-小鼠由于体内胆小管磷脂转运体被靶向破坏，胆磷脂分泌障碍，胆汁中非胶束结合的游离胆汁酸浓度增加，高浓度胆汁酸渗漏到门脉中，诱发炎症和胆管增生，最终导致胆管周围纤维沉积［20-21］。本研究发现黄芪总苷可改善这2种胆汁淤积性肝纤维化模型小鼠肝组织病理变化，减少肝组织胶原阳性面积和HYP 水平，抑制肝组织α-SMA、Col1a1、Col4a1 和TGF-β1 的表达，以56 mg/kg 剂量效果更佳。

综上所述，黄芪总苷可发挥抗胆汁淤积性肝纤维化的作用，其初步作用机制与促进SIRT1 表达，抑制下游TGF-β1 表达相关。