彭佳佳，张小军，田 鑫，杨燕君，段国锋，高 鹏，刘群龙,

（1.山西农业大学园艺学院，山西晋中 030801；2.山西农业大学果树研究所，山西太原 030031）

核桃（Juglans regiaL.）为胡桃科核桃属落叶乔木，是世界“四大干果”之一[1]。核桃仁含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、人体必需的钙、磷、铁等多种微量元素以及维生素E、核黄素等多种维生素，具有较高的营养价值，深受消费者喜爱[2-4]。游离氨基酸作为维持人体健康的营养成分之一，可被人体直接吸收利用，参与人体氮代谢和免疫调节作用[5-7]，也可与口腔中的味蕾结合产生酸、甜、苦、鲜或咸等滋味[8]。已有研究表明，具内种皮核桃仁中含有17 种氨基酸，且必需氨基酸占总氨基酸含量的1/3 左右[9-12]。杨永涛等[9]研究表明，具内种皮核桃仁氨基酸比例系数贴近全鸡蛋蛋白模式，适合人体吸收，为优质蛋白来源。毛晓英等[10]研究表明，具内种皮核桃仁必需氨基酸含量高于联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）推荐值，可作为营养食品添加到其它食品中以满足人体对必需氨基酸的需求。具内种皮核桃种仁中药用氨基酸含量较高，与枸杞中含量相近，可作为药用价值较高的植物蛋白资源进行开发利用[11]。

核桃内种皮是包裹核桃种仁的一层种皮结构，占核桃仁质量的5%左右[13]，但在生产加工过程中常被废弃，缺乏对其的合理开发利用。核桃内种皮含有丰富的维生素、矿物质、蛋白质和脂质等物质，营养价值较高[14-15]，其含有的酚类、氨基酸等物质亦可丰富核桃仁滋味。谢素雅等[15]研究表明，核桃内种皮含有16 种氨基酸，7 种必需氨基酸占氨基酸总量33.16%。目前，有关核桃内种皮氨基酸的呈味特性和营养价值评价的相关研究较少，且以单一品种为主[15]。为探究不同品种核桃内种皮游离氨基酸组成及含量差异，本研究通过对6 个品种核桃内种皮中游离氨基酸含量的测定，并分析其呈味特性和营养价值，以期为核桃副产物的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

‘农核1 号’、‘汾核2 号’、‘汾核4 号’、‘京861’、‘薄壳香’和‘金薄香8 号’共6 个核桃品种 山西农业大学果树研究所核桃种质资源圃，树龄15 年，每个品种选取6 株树随机组合为三组，每组2 棵树，设3 个重复；17 种氨基酸标准品 色谱级，北京索莱宝科技有限公司；磺基水杨酸、盐酸等试剂 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

Biochrom30+氨基酸分析仪 德国Biochrom公司；冷冻干燥机 美国GOLD-SIM 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 材料预处理 于2020 年9 月核桃果实成熟时，从植株的东、南、西、北4 个方向和树冠内外随机采集30 个核桃青皮颜色由绿色渐变为黄绿色、顶部出现裂缝且无病虫害的果实带回实验室，脱青皮后打开坚果，用镊子将核桃种仁和内种皮剥离，液氮速冻，再冷冻干燥后研磨成粉，-20 ℃干燥保存，待测。

1.2.2 游离氨基酸含量测定 称取0.5 g 内种皮干粉于离心管中，加入5 mL 盐酸（0.02 mol/L）于4 ℃冷藏过夜后12000 r/min 离心15 min。取1 mL 上清液加入1 mL 质量分数为4%的磺基水杨酸，充分混匀后用0.22 μm 的水系滤膜过滤到棕色进样瓶。测定采用Biochrom 30+氨基酸分析仪测定，测定方法参照贺娜等[16]的方法，并计算必需氨基酸比例E/T 值、E/N 值、RAA 值、RCAA 值和滋味活性值（TAV）。其中E/T=（EAAs/TFAAs）×100，E/N=（EAAs/NEAAs）×100；RAA=内种皮中某种必需氨基酸含量/FAO/WHO 提出的含量；RCAA=内种皮中某种必需氨基酸的RAA/必需氨基酸RAA 的均值，TAV=C/T。式中，EAAs 表示必需氨基酸含量；TFAAs 表示游离氨基酸总量；NEAAs 表示非必需氨基酸含量；C 表示样品中呈味物质含量；T 表示各氨基酸味道阈值。

1.3 数据处理

实验结果采用Excel 2013 软件对数据进行整理，SPSS 20.0 软件进行方差分析、主成分分析、聚类分析和聚类结果作图。

2 结果与分析

2.1 不同品种核桃内种皮游离氨基酸含量

6 个核桃品种内种皮中均含有17 种游离氨基酸（表1）。不同核桃品种内种皮总游离氨基酸含量为2673.86～3490.21 mg/kg，平均为2972.01 mg/kg。‘汾核2 号’含量最高，与其余品种差异明显。‘京861’含量最低，最高值/最低值的比值为1.31。6 个核桃品种中必需氨基酸含量差异较小。‘汾核4 号’必需氨基酸与总氨基酸的比值（E/T）最高，为30.77%，‘京861’最低，为20.48%，平均值为25.07%。必需氨基酸与非必需氨基酸的比值（E/N）中‘农核1 号’最高，为53.18%，‘京861’最低，为38.15%，‘农核1 号’和‘汾核4 号’内种皮中氨基酸比较接近WHO/FAO提出的理想蛋白模型（理想蛋白模型中E/T 在40%左右，E/N 接近60%）。内种皮中9 种药用氨基酸（Leu、Lys、Met、Phe、Arg、Asp、Glu、Gly、Tyr）含量为1582.72～2188.88 mg/kg，占氨基酸总量的57.67%～68.23%，各品种中含量差异较大。因此，核桃内种皮的营养价值较高。

表1 核桃内种皮游离氨基酸含量（mg/kg）Table 1 Content of free amino acid in walnut pellicle (mg/kg)

由表1 可知，不同核桃品种内种皮中各游离氨基酸含量差异显著（P<0.05）。Arg 在6 个品种间上差异最大，其在‘京861’中含量最高，是‘汾核4 号’（含量最低）的4.74 倍，Arg 是药用氨基酸，有助于恢复免疫细胞的抗肿瘤能力，增强细胞免疫力[6]。‘汾核4 号’内种皮Leu 含量与其它5 个品种之间差异较小。Glu 为6 个品种内种皮中含量最高的氨基酸，占总量的26.23%～32.74%，这与在‘香玲’核桃[15]、新疆核桃[9,17]、山核桃[13]和漾濞大泡核桃[18]中的研究结果相似。Glu 作为一种兴奋型神经递质，与认知能力有关，对大脑中与学习记忆有关的神经元有重要作用[7]。内种皮中Asp 含量较高，其与Glu 共占游离氨基酸总量33.99%～46.20%。已有研究表明Glu和Asp 含量对蛋白质含量影响较大[17]，因此，Glu 和Asp 可能为影响内种皮蛋白质的主要游离氨基酸。内种皮中含量较高的氨基酸还有Thr、Cys 和Arg，与Glu 及Asp，5 种氨基酸共占氨基酸总量的77.02%～81.44%，为内种皮游离氨基酸的主要成分。

2.2 核桃内种皮RAA、RCAA 评价

内种皮中的必需氨基酸较WHO/FAO 氨基酸模式[9,11]中的标准偏小（见表2）。RCAA 值表示偏离标准模式的大小，RCAA>1 表示该必需氨基酸在内种皮中相对过剩，RCAA<1 表示该必需氨基酸在内种皮中相对不足，RCAA 为1 表示该必需氨基酸在内种皮中为理想平衡状态，RCAA 最小的必需氨基酸为限制氨基酸。由表2 可知，内种皮中的第一限制性氨基酸为Leu，第二限制性氨基酸为Val，Thr、Ile 和含硫氨基酸在内种皮中相对过剩，表示核桃内种皮可以为人体补充丰富的Thr、Ile 和含硫氨基酸，与其它果蔬混合食用，可提高不同食物的利用效率。

表2 核桃内种皮必需氨基酸RAA、RCAA 值Table 2 RAA and RCAA values of essential amino acids in walnut pellicle

2.3 核桃内种皮中氨基酸的呈味特征分析

6 个核桃品种内种皮共检测出鲜味氨基酸3 种（Glu、Asp、Lys）、苦味氨基酸6 种（Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、Arg）、甜味氨基酸6 种（Thr、Ser、Pro、His、Gly、Ala）和芳香族氨基酸2 种（Tyr、Phe）。由表3 可知，‘汾核2 号’呈味氨基酸总量最高（3075.43 mg/kg），‘京861’最低（2344.48 mg/kg），‘汾核2 号’是‘京861’的1.30 倍。不同核桃品种中各呈味氨基酸含量存在差异，鲜味氨基酸是含量最高的呈味氨基酸，占呈味氨基酸总含量的41.77%～55.28%。除‘汾核2 号’和‘汾核4 号’外，其余品种的苦味氨基酸含量均高于甜味氨基酸含量，‘汾核2 号’和‘汾核4 号’中苦味氨基酸与其余品种均存在显著差异（P<0.05），芳香族氨基酸为含量最低的呈味氨基酸且各品种间差异较小。综上，内种皮中呈味氨基酸差异与核桃品种有关，鲜味氨基酸为内种皮呈味氨基酸含量最高，芳香族氨基酸为含量最低。

6 个核桃品种内种皮各呈味氨基酸TAV 值见表4。TAV 是表示样品中呈味物质浓度与其味道阈值的比值，反映样品中呈味物质的滋味强度，当TAV>1 时，表示该氨基酸对内种皮滋味影响较大；当TAV<1 时，表示其对内种皮滋味影响不大。由表4 可知，TAV>1 的呈味氨基酸主要为Glu（鲜味氨基酸）和Arg（苦味氨基酸）。6 个品种中Glu 的TAV值为2.34～3.81，均值为2.94，为影响内内种皮鲜味的主要氨基酸。同时，Glu 是黄花菜和蘑菇中鲜味的活性成分之一[19-20]。Glu 还具有掩盖苦味的功效，可抑制味觉受体中Ca2+信号传递[21]，降低苦味氨基酸Ile 的强度[22]。‘京861’、‘薄壳香’和‘金薄香8 号’中Arg 的TAV 值为1.03～1.26，对该品种内种皮的苦味有重要影响。在课题组前期口感评价中，‘京861’、‘薄壳香’和‘金薄香8 号’苦味程度低于‘汾核2 号’和‘汾核4 号’[23]，与本研究结果存在差异，这可能与Arg 的特殊呈味性有关。天然物质中Arg以L 型存在，呈苦味，具有抑制苦味的特殊作用，可通过掩盖/结合味觉上的苦味受体或与味觉中的Na+通道相互作用，降低对L-Ile、L-Phe 等苦味氨基酸和奎尼溶液苦味的感知[8,24-26]，同时Arg 可与单宁[27]、苯甲地那铵和对乙酰氨基酚相互作用[28]，降低苦味化合物的苦味强度。因此，Arg 对‘京861’、‘薄壳香’和‘金薄香8 号’的苦味作用为呈味抑制效应，它可能通过掩盖苦味受体或与内种皮中苦味分子结合而造成内种皮中其它苦味物质苦味强度的减小。内种皮中大部分苦味氨基酸含量低于阈值，Lioe 等[29]研究表明Phe含量低于阈值时可增强其它氨基酸的甜味和鲜味，由此可见内种皮中低于阈值的苦味氨基酸增加其呈味的复杂性。时羽杰等[30]研究表明L-Leu 为核桃内种皮苦涩味差异代谢物，而本研究中各品种内种皮中L-Leu 含量均低于阈值，对内种皮苦味贡献较小。这可能由于前者研究中所有试材为内种皮口感极具苦味的CZ-301 和无苦味且略带甘甜的CZ-64，本研究中6 个品种核桃内种皮都具有不同程度的苦味，故L-Leu 对内种皮苦味影响差异与核桃品种有关。

表4 核桃内种皮呈味氨基酸TAV 值Table 4 TAV values of flavor amino acids in walnut pellicle

2.4 不同品种核桃内种皮氨基酸含量的主成分分析

对6 个品种内种皮中17 个游离氨基酸含量进行主成分分析，可使各主成分含义更加明确。初始因子载荷矩阵进行旋转后共提取出4 个特征值大于1 的主成分（见表5），方差贡献率依次为31.95%，23.73%，22.20%，18.72%，累计方差贡献率为96.59%，高于阈值85%，因此4 个主成分可以代替17 个指标对内种皮游离氨基酸进行分析，主成分线性关系分别为：

表5 游离氨基酸主成分特征值和贡献率Table 5 Eigenvalue of the principal components and cumulative contribution rates in free amino acid

由表6 可知，PC1 在Lys、Asp、Cys、Glu 和Tyr 有较高的载荷，均高度正相关，表明PC1 对内种皮的非必需氨基酸影响最大，称为非必需氨基酸因子。PC2 中Met 和Val 载荷值分别为0.87 与0.99，且存在正向影响，可称为必需氨基酸因子。PC3 中Leu、Thr 和Ser 载荷较大，并与PC3 呈正相关，可称为甜味氨基酸因子。PC4 的方差贡献率最低，其中Ile 和Ala 的特征向量值较高，为正值，可称为苦-甜味混合氨基酸因子。4 个主成分从营养和滋味方面反映了核桃内种皮游离氨基酸的综合品质，以每个主成分对应的方差相对贡献率作为权重建立综合评价模型F=0.33F1＋0.25F2＋0.23F3＋0.19F4，最终获得6 个核桃内种皮综合质量分值及排名（表7），从高至低的排序为‘汾核2 号’、‘农核1 号’、‘汾核4 号’、‘金薄香8 号’、‘薄壳香’、‘京861’。其中‘汾核2 号’综合得分最高，为0.69，表明其氨基酸综合质量水平较高，‘京861’得分最低为-0.74，表明其氨基酸综合质量水平较低；‘薄壳香’和‘京861’因子综合得分为负值，表明其氨基酸综合质量水平低于平均水平。结果表明，营养成分因子PC1 和PC2 对内种皮中氨基酸的综合质量影响较大。因此，营养成分因子PC1 和PC2 对内种皮中氨基酸综合质量影响较大，‘汾核2 号’为氨基酸综合质量水平较高的品种。

表6 游离氨基酸主成分载荷矩阵与系数Table 6 Principal component load matrix and coefficient of free amino acid

表7 核桃内种皮中游离氨基酸成分得分和综合得分Table 7 Principal component scores and comprehensive assessment of free amino acid in walnut pellicle

2.5 核桃内种皮游离氨基酸的聚类分析

依据核桃内种皮中游离氨基酸的含量，采用pearson 相关性测定了6 个核桃品种的组间连接距离，得到树状聚类图（图1）。6 个核桃品种可划分为两大类，第一类为‘薄壳香’、‘金薄香8 号’、‘农核1 号’和‘京861’，该类核桃内种皮中苦味氨基酸与甜味氨基酸含量比值大于1，且‘薄壳香’和‘金薄香8 号’最先进行第一阶聚类，该阶聚类的2 个品种中苦味氨基酸与甜味氨基酸含量比值、氨基酸总量和必需氨基酸含量均相差较小；‘农核1 号’的苦味氨基酸与甜味氨基酸含量比值与第一阶聚类的2 个品种的平均比值之间差距较小，进行第二阶聚类，‘京861’的苦味氨基酸与甜味氨基酸含量比值与第一阶聚类的2 个品种的平均比值差距较大，则为第三阶聚类；第二类为‘汾核2 号’和‘汾核4 号’，其苦味氨基酸含量与甜味氨基酸含量的比值小于1，且必需氨基酸和鲜味氨基酸含量均高于第一类。因此，‘汾核2 号’和‘汾核4 号’为滋味品质和氨基酸营养价值较高的品种。

图1 不同核桃品种内种皮游离氨基酸的聚类图Fig.1 Cluster of free amino acid in different walnut pellicle

3 结论

核桃内种皮中游离氨基酸差异明显，各品种游离氨基酸含量为2673.86～3490.12 mg/kg，Glu、Asp、Thr、Cys 和Arg 为内种皮游离氨基酸的主要成分，占游离氨基酸总量的77.02%～81.44%，其中Glu 含量最高，占总量的26.23%～32.74%。药用氨基酸为内种皮中差异较大的组分之一，占游离氨基酸总量57.67%～68.23%，因此，核桃内种皮具有较高的药用价值，可依据其药理作用进行合理开发利用。必需氨基酸含量为547.71～885.14 mg/kg，不同品种间差异较小。Leu 是内种皮第一限制性氨基酸，第二限制性氨基酸为Val。

内种皮中呈味氨基酸模式与核桃品种有关，鲜味氨基酸为含量最高的呈味氨基酸，芳香族氨基酸含量最低，除‘汾核2 号’和‘汾核4 号’外，其余品种苦味氨基酸含量均高于甜味氨基酸含量。经TAV 计算，6 个品种中Glu 的TAV 值为2.34～3.81，对内种皮鲜味贡献最大。‘京861’、‘薄壳香’和‘金薄香8 号’中Arg 的TAV 值为1.03～1.26，对内种皮苦味有贡献，具呈味抑制作用。

本研究明确了‘农核1 号’、‘汾核2 号’、‘汾核4 号’、‘京861’、‘薄壳香’和‘金薄香8 号’6 个品种核桃内种皮游离氨基酸主要成分，证实了必需氨基酸、药用氨基酸和呈味氨基酸组分在不同品种中存在差异。但研究中所选用试材品种较少，后续研究将再此基础上扩大品种数量，对核桃内种皮氨基酸组分进行深入研究，以期筛选富含药用氨基酸的特异种质，提高核桃经济价值。