张馨方 胡原彰 陈薇薇

(安顺学院农学院，贵州 安顺 561000)

1 引言

1.1 雪胆概况

雪胆是西南民间的常用药，基源为葫芦科(Cucurbitaceae)翅子瓜族(Subtrib.ZanoninaePax)雪胆属(Hemsleya)多种植物的块茎[1]。多年生攀援草本。茎和小枝纤细，疏被短柔毛。趾状复叶由5-9小叶组成，多数为7小叶，复叶柄长7-8厘米。花雌雄异株。雄花：疏散聚伞总状花序或圆锥花序。种子黑褐色，近圆形，长1-1.2厘米，宽1厘米。花期7-9月，果期9-11月。根据形态特征可分为四个组：雪胆组(Sect.Hemsleya)、曲莲组(Sect.Amabiles)、马铜铃组(Sect.Graciliflorae)和肉花雪胆组(Sect.Carnosiflorae)。

根据《中国植物志》的记录，这个属共有31种植物，主要分布在亚洲亚热带到温带地区。该属植物的主要分布区域是云南贵州高原到四川中部盆地边缘的山地区域，在中国的西南地区广泛分布，包括云南省、贵州省和四川省，三省拥有全属植物的92%，其中在贵州省分布约6种。经过人们对雪胆属植物化学成分的深入研究，发现由于生长条件、产地和物种等诸多因素的影响，导致不同的雪胆属植物所含有效成分的含量存在一定的差异。到现在为止，已经用化学研究的方法，对100多种化合物进行了分离识别，其中大部分是三萜类化合物[2]。雪胆属植物的有效成分包括两类三萜皂苷-葫芦素和齐墩果烷，这些成分赋予了雪胆在抗炎、抗癌等方面的活性作用[3]。雪胆具有抗菌消炎、清热解毒等功效，在临床上治疗冠心病、肠炎、气管炎等多种疾病时也用到了此药材，并对保肝、抗癌也发挥极大的作用[4-5]。

1.2 雪胆研究现状

报道称，中药雪胆在我国的西南省、区被广泛地用于生药入药。含多种药物的有效成分，这些成分包含了雪胆甲素、雪胆乙素和竹节参皂甙Ⅳa 等。近几年，对雪胆的活性成分进行了研究。中药性组分的药理学效应研究发现，雪胆乙素对其有显著的抑制作用，在降低与炎性有关的细胞因子的情况下，激活和增殖小鼠的淋巴细胞基因的表达，调节获得性免疫，起到抗炎作用[6]。雪胆甲素可有效抑制非小细胞肺癌细胞系NCI-H460和A549的生长，因此可以用作抗非小细胞肺癌的化合物，有望成为相关研究的重要组成部分[7]。在临床上，将雪胆甲素与雪胆乙素进行组合，就可以制成雪胆素片，这种药物对由甲苯造成的小鼠耳肿胀和大鼠足趾角叉菜胶能在某种程度上阻止红细胞的膨胀，并能有效地缓解因氨所致的咳嗽[8]。

在四川和云南分别以“金龟莲”和“罗锅底”入药，贵州地区常称雪胆属药用植物为“蛇莲”“苦金盆”，贵州为雪胆商品药材的重要产地，除作为民间用药外，在世界知名制药公司“神奇药业”以雪胆为主要原材料，成功研制“雪胆素片”。

1.3 研究目的及意义

雪胆作为民间常用药，目前国内市场对雪胆的需求量达到3000吨左右。据相关资料显示，近年来对雪胆的需求量逐年增加，加之生长周期长，其野生资源也不断枯竭，加强对雪胆植物的有效利用更为重要。目前雪胆药材质量控制标准尚不明确，不同的地方标准中入药所用的雪胆基源种不同，致其基源混乱，难以鉴别。甚至有防己科千斤藤属 (StephaniaLour.)多种植物的块茎混为雪胆出售现象。本项目通过收集贵州省内雪胆主产地的雪胆块茎样品，对其有效成分的含量进行检测，进而分析其化学质量特征，以期为药用品质优良的种质资源遴选提供依据。

2 材料和方法

2.1 材料与仪器

2.1.1 材料与指标

收集分布于贵州雪胆药材主要产区的4种雪胆属药用植物，具体信息见表2-1。清洗所取得的雪胆块茎，对其进行称量、切片，将其烘干，烘干后的样品放入粉碎机中打粉成粉末状，过40目筛后装于密封袋内，用于雪胆甲素、雪胆乙素、竹节参皂甙Ⅳa、总皂甙、总多糖、含水量及醇溶性浸出物的含量检测。

表2-1 雪胆药材信息表

2.1.2 主要仪器

HPLC(Agilent 1260 型)，配置InertSustain C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱、自动进样器、DAD 检测器、柱温箱、四元泵、超声波清洗机、纯水仪、紫外分光光度仪、电子天平、索氏提取器、离心机、粉碎机、烘箱、移液枪、移液枪枪头、离心管、试管、试管架、玻璃棒、烧杯、烧瓶、分液漏斗、电炉等。

2.1.3 试剂与试药

雪胆乙素、竹节参皂甙Ⅳa 和雪胆甲素标准品(HPLC≥98%)，齐墩果酸标照品，均购买于成都曼思特公司；D-葡萄糖苷标准品(KYFH-P6SJ，中国食品与药物检验研究所)；无水乙醇，苯酚，冰乙酸，高氯酸，石油醚，浓硫酸，甲醇，正丁醇，香草醛等。

2.2 试验方法

使用热浸法对乙醇溶解浸出物进行测定；通过 HPLC方法对雪胆甲素、雪胆乙素和竹节参皂甙 IVa进行测定；采用紫外光分光光度分析方法，对总皂甙、多糖进行测定。最后采用SPSS Statistics 26.0软件对主要活性成分进行相关性分析、主成分分析和系统聚类分析。

3 分析与结果

3.1 雪胆甲素、雪胆乙素、竹节参皂甙Ⅳa的测定

3.1.1 活性成分的提取

使用精密称量器称取1.0 g样品粉末并放置于圆底烧瓶中，随后精密加入25.00mL无水乙醇并再次称重。待溶液降温到常温后，用无水乙醇补偿损失并振动均匀。使上层清液通过孔径为0.22um的过滤薄膜过滤，以备后用。每个试样重复检测三次。采用 InertSustainC18柱头对三种组分进行了同步分析，分别考察了峰形、分离度、分析时间及体系的稳定性。在25℃、30℃、35℃的柱子温度下，采用渐变的淋滤。淋洗程序为0.1%磷酸水溶液-甲醇和0.1%磷酸水溶液-乙腈[9]。

3.1.2 标准曲线的制作

要确认在混合对比品溶液中，雪胆甲素、雪胆乙素和竹节参皂甙IV a的质量浓度，就必须精确地称量这三种对照品，并根据需要，将其配制成具有0.075 mg/mL、0.810 mg/mL、0.620 mg/mL的混合溶液。为了进一步检验混合对照品溶液中的成分，需要精确吸取0.5uL、1uL、5uL、10uL、20uL、30uL、50uL、70uL、100uL的混合溶液，并测定进样量x(g)与峰面积y之间的关系。通过制备出三种成分的标准曲线，并进行回归分析，可以找出它们之间的线性关系。

表3-1 活性成分进样量及峰面积

表3-2 竹节参皂甙Ⅳa和雪胆素的线性方程及线性范围

3.1.3 HPLC色谱图

图3-4 对照品的HPLC色谱图

图3-5 母猪雪胆HPLC色谱

图3-6 文山雪胆HPLC色谱

图3-7 罗锅底HPLC色谱

图3-8 肉花雪胆HPLC色谱

3.1.4 样品溶液的测定

雪胆属4种植物的3种主要化学成分含量检测结果见表3-3。由图3-9可见，3种活性成分的平均含量由高到低依次为雪胆甲素>竹节参皂甙Ⅳa>雪胆乙素，且竹节参皂甙Ⅳa与雪胆乙素含量差别极小。

图3-9 雪胆属植物的3种主成分比较

表3-3 雪胆属4种植物主要化学成分的含量

从图3-9可直观地看到，在4种雪胆属植物中，雪胆甲素的含量变化幅度较大，其次是竹节参皂甙IVa。雪胆甲素的含量，以肉花雪胆最高，其次依次为母猪雪胆、罗锅底，文山雪胆最低。但竹节参皂甙IVa的含量以文山雪胆最高，其次依次为母猪雪胆、罗锅底，肉花雪胆最低。

3.2 含水量和醇溶性浸出物含量测定

水分和醇溶性浸出物的含量测定分别参照《中国药典》中的水分测定法下的烘干法和《中国药典》中的醇溶性浸出物测定法项下的热浸法进行测定[10]。

试验以热浸出方式进行。首先，将2g试样与100mL70%酒精混合，置于黑暗中放置1h，再用回流萃取1h。等待冷却后，将所得到的溶液准确地计量出来，然后用酒精补充所失去的量。之后，取25 mL的提取液，在水浴中蒸发，并在105℃下进行3h的干燥，在冷却后，迅速地将其进行称量，最终得到了乙醇可溶提取液的质量分数，计算出醇溶性浸出物的含量。

在中药贮藏过程中，水分是确保中药品质的一个关键因素，同时也是库藏中草药品质改变的重要原因。醇溶性浸出物的测定主要是控制质量，是为了体现药材本身药用价值的基本数据。由表3-4可知，S3-2样品的含水量最高，为53.14mg/g；S4-2的含水量最低，为20.45mg/g。S4-2的醇溶性浸出物含量最高，为86.31mg/g；S3-1的醇溶性浸出物的含量最低，为55.69mg/g。

3.3 总皂甙含量的测定

3.3.1 供试液的制备

每个样品各称取粉末1.0g，加入70%乙醇100mL，提取2h，共提取4次。将滤液合并后挥干溶剂，用蒸馏水定容到100mL，先用20mL石油醚脱脂，脱脂完成后再用适量正丁醇萃取，待其挥干萃取液后制得供试液。

3.3.2 对照品溶液的制备

将10.5mg的齐墩果酸对照品放入烧杯中，先用适量甲醇进行溶解，溶解后再加入足量甲醇，使总体积为10mL，制成对照品溶液，于4℃冰箱保存。

3.3.3 标准曲线的制备

取6根10 mL试管并编号，在试管中分别加入比较品溶液0.0 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL。将试管置于水浴罐内，使其散发出甲醇。在蒸干后，加入新调配好的5%的香草醛-冰醋酸0.2mL，高氯酸0.8mL。之后，将其置于60℃的热水盆中加热13min，然后置于冰水盆中5min。然后再添加5 mL的冰乙酸，进行摇匀，并于540 nm测量其吸收值[11]。以齐墩果酸对照品浓度为横座标X，以吸收度为纵座标X，制作出了一条标准曲线，得出了如下的回归公式：Y=7.925 X-0.046(R2=0.990)，显示出在0.0403-0.1211 mg/ml之间具有较好的线性关系。

3.3.4 样品溶液的测定

取样品溶液0.4ml，按照标准曲线的制备方法测定样品，总皂甙含量的计算对照标准曲线方程进行。结果见表3-5。

表3-5 总皂甙含量

用紫外分光光度法测定方法对雪胆属药用植物总皂苷的含量进行测定，由表3-5可知，本次所取的雪胆样品总皂甙含量在3.99575-1.483525mg/g范围内，其中S4-1含量最高，为3.99575mg/g，S2-1含量最低，为1.483525mg/g。

3.4 总多糖含量测定

3.4.1 供试液的制备

每个样品各称取粉末1.0g，加入100mL蒸馏水，提取2.5h，共提取4次，过滤并合并滤液。取5.0mL上述过滤液于50mL离心管中，再加入20 mL无水乙醇混合均匀，然后在3000 r.min-1离心5 min后。即得供试液。

3.4.2 对照品溶液的制备

将无水葡萄糖称取3.00mg，放入一个容量为25mL的容量瓶中。再添加适当的蒸馏水使之溶于水中，充分溶于水后，用蒸馏水将其定容至刻度并进行摇动，从而获得标准物质的浓度为0.12mg/mL。

3.4.3 标准曲线的制作

分别吸取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的对照品溶液，补充足够的蒸馏水到1.0mL，然后添加5%的石碳酸溶液0.5mL，浓硫酸溶液5.0mL，经过5min的沸腾水浴，7min的冰水浴，待其冷却后再添加蒸馏水，将它定容至刻度；然后摇一摇，使其混合冷却后，在490 nm处测量吸收值[12-13]。用X轴为多糖组分，Y轴为吸收率，分别画出了各单糖组分的变化规律。

标准曲线为 Y=64.106 X+0.047 (R2=0.9997)，说明在0.00172 mg/ml—0.0214 mg/ml的范围内，葡萄糖具有较好的线性。

3.4.4 样品溶液的测定

用0.4mL的样本液，添加0.6 mL蒸馏水之后，根据标准曲线的制备方法展开测定，然后与标准曲线相结合，可以计算出样品的总多糖含量。

使用紫外分光光度法和索氏提取法对雪胆属药用植物总多糖含量进行了测定。由表3-6所知，本次所取的雪胆样品总多糖含量在27.61258-38.446494mg/g范围内，4种雪胆的总多糖含量平均值分别为34.68560867mg/g、35.3053mg/g、30.19818867mg/g、31.37346533 mg/g。其中S1-3的总多糖含量最高，为38.446494mg/g，S3-1的总多糖含量最低，为27.61258mg/g。

表3-6 不同地区雪胆总多糖含量

3.5 结果分析

采用SPSS Statistics 26.0软件对样品的主要活性成分进行相关性分析、主成分分析和系统聚类分析[14]。

3.5.1 相关性分析

对贵州省雪胆属植物所测的3种主要化学成分进行相关性分析，结果如表4-1所示。3对化学成分组合中雪胆乙素与雪胆甲素这1对成分呈现极显著相关(P<0.01)，且为正相关。

表4-1 各成分相关性

3.5.2 主成分分析

通过对雪胆7项质量指数的主成分分析，得出了7项质量指数。以各主成分的特征值和贡献率为基础，进行了主成分分析。本次试验提取出了两个主成分，累计方差贡献率为83.253%，说明所抽取的两个主要成分对雪胆的品质指数有较好的说明作用。在这些因素之中，第一主成分的特征值是4.262，方差贡献率达到了60.886%，是最为显著的主要成分。第二个主成分的特征值是1.566，对方差的贡献率是22.367%。虽然其重要性次于第一主成分，但仍然是一个非常重要的主成分，可以作为雪胆药材选优、评价的综合指标。主成分1主要是综合了雪胆属植物的雪胆甲素、雪胆乙素和总皂苷含量，贡献率分别是97%、95.6%和78.1%；主成分2主要是综合了醇溶性浸出物、总多糖和竹节参皂甙Ⅳa含量，贡献率分别是75%、72.5%和20%。

2个主成分的得分函数可以由矩阵系数和标准化后的数据得到。分别为：

Y1=0.224X1+0.228X2-0.145X3-0.124X4+0.183X5-0.209X6+0.137X7，

Y2=-0.019X1+0.110X2+0.128X3+0.463X4-0.330X5-0.238X6+0.479X7。

利用2个主要成分，以各主分相应的特征分量与各主分特征分量总和的比率为加权，求出了一个综合主成分模型：

F综合 = 0.60886Y1 + 0.22367Y2。

综合主成分的分值越高，则综合性状表现越好。所以，可以依据这个综合主成分模型来评估各个样本的综合性状表现。如表4-2所示，4种雪胆的综合得分和排序的药材质量品质排序为肉花雪胆>母猪雪胆>罗锅底>文山雪胆。

表4-2 雪胆质量综合评价

3.5.3 基于化学成分的聚类分析

基于各类成分含量进行系统聚类分析，选择组间连接，平方欧式距离为距的测量公式，绘制聚类树状图，如图4所示，当距离为2时，可将雪胆属4种植物聚为2类。其中，肉花雪胆独为第I类，该种的雪胆甲素、雪胆乙素、总皂甙和醇溶性浸出物含量较高，竹节参皂甙Ⅳa和含水量较低。母猪雪胆与文山雪胆先聚为一小类后，与罗锅底聚在一起，其中罗锅底的雪胆乙素和含水量较高，竹节参皂甙Ⅳa含量较低。

图4 雪胆属植物聚类分析

图5 不同雪胆属的活性成分含量

4 结果与讨论

4.1 试验结果

从化学成分的含量测定结果来看，雪胆属植物的雪胆甲素含量，除文山雪胆外，均高于其他成分，可作为含量测定的有效成分。从主成分分析的综合评价来看，肉花雪胆的综合质量评价值最高，可作为雪胆药材基源植物。此外，如果以雪胆甲素和雪胆乙素作为指标评价雪胆药材质量的标准，母猪雪胆和罗锅底均可作为候选药源。4种雪胆属植物的竹节参皂甙Ⅳa含量与雪胆素含量呈现较大差异，其中文山雪胆的雪胆素含量虽然最低，但竹节参皂甙Ⅳa含量却是最高的。因此，尽管其雪胆素含量低，但可作竹节参皂甙Ⅳa的药源植物。

4.2 讨论

雪胆是我国一种重要的药用植物资源，市场需求量也较大。当前，在很大程度上依赖于从野生植物中获得。但近年来，已经有一些人工栽培的雪胆，在市面上出售。经调查，市场上出现的大多是药农挖取野生的雪胆植株后在家种植的，大多数种植时间为3-5年。目前，雪胆资源正面临危机，野生资源数量不断减少。资料记录显示，在贵州地区，雪胆块茎共有8种，1个原亚种和3个原变种，但本次试验收集到的雪胆基源仅有肉花雪胆(Hemsleyacarnosiflora)、母猪雪胆(Hemsleyavillosipetala)、文山雪胆(Hemsleyawenshanensis)和罗锅底(HemsleyaMacrosperma)4种。市场调查和走访药农均表示，目前野生雪胆越来越少，且个头较大的雪胆块茎难寻，市面上出现个头大的块茎大多数基本都是通过后期人工种植的。野生资源的过度挖采，也制约了其药用价值的扩大。利用组培技术，可以加快雪胆植物的选育进程，实现其大规模的人工种植。同时，这也是解决资源匮乏问题和有效保护雪胆属植物的有效方法之一[15]。

在选择药源时，除了需要考虑有效成分的指标，还需要充分考虑资源的贮藏量。结合雪胆属植物空间分布格局的特征，主产肉花雪胆的纳雍、织金两地呈集群分布，已经有一定的规模化引种栽培，并形成了商品，因此肉花雪胆可作为首选药源，在今后的研究中应该引起重视。

在皂苷的提取方面，除了地下部分，也可开发地上部分，赵敏彤等[16]发现雪胆同科植物绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)叶的活性成分主要是皂苷类化合物，有抗肿瘤，降血脂的效果，因此可以进一步对雪胆属植物的地上部分加以探索，提高雪胆属植物的利用。