刘鸣昊，黄亚森，张振凌，张丽慧，刘素彤，赵文霞

（1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450006；2.河南中医药大学，河南 郑州 450046）

化痰祛湿活血方是第二届全国名中医赵文霞教授根据非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）“痰湿内停、瘀血阻络、肝失条达”的病机而制定的复方，该方由泽泻、海藻、丹参、郁金、水飞蓟、决明子、山楂、柴胡8味中药组成。方中泽泻利水渗湿，行气消瘀，为君药。丹参活血化瘀，凉血安神；郁金活血止痛，行气解郁；海藻化痰利湿，软坚消痰。三药共为臣药。决明子清肝明目，山楂消积散瘀，水飞蓟清热解毒。三药共为佐药。柴胡疏肝理气，为使药。全方共奏化痰祛湿活血之功。前期研究[1-4]证实，化痰祛湿活血方具有良好的抗NASH作用。文献研究显示，决明子生品长于清肝热；净山楂长于活血化瘀。麸炒泽泻长于渗湿和脾，降浊以升清，利尿作用较生品显著增强；而盐泽泻几乎无利尿作用，23-乙酰泽泻醇B为其主要有效成分，且在泽泻中含量较高；麸炒泽泻中23-乙酰泽泻醇B质量分数高于生品，而其他炮制品质量分数均低于生品[5-7]。丹参酒制后，寒凉之性缓和，活血祛瘀、调经止痛之功增强；丹参酒炙后化学成分的种类和含量变化显著，其中二氢丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅰ的峰面积增加，隐丹参酮、丹参新醌乙、丹参酮ⅡA和丹参新酮的峰面积明显降低，紫草酸或丹酚酸H、丹参酮ⅡB色谱峰消失,推测丹参酒炙后活血化瘀作用的增强与所含成分转化为体内更易吸收的活性成分有关[8-10]。醋郁金能够引药入血，增强舒肝止痛作用。郁金炮制品的药效学研究发现，醋郁金在止痛方面作用最强[11]。醋柴胡引药入肝，疏肝解瘀止痛效果最佳。柴胡醋炙后会使原生皂苷向次生皂苷转化，醋柴胡疏肝解郁作用强于生品[12]。化痰祛湿活血方原方饮片均为生品，未使用以上炮制品。目前尚无研究对不同煎煮方法有效成分溶出进行过比较。

本课题组在前期实验中已对饮片质量进行检测，均符合2020年版《中华人民共和国药典》（一部）规定，并基于正交试验对化痰祛湿活血方标准汤剂进行研究。其煎煮工艺为：加12倍量水、浸润60 min、煎煮30 min、煎煮3次。故本研究基于中药炮制理论，采用高效液相色谱（HPLC）法比较将方中泽泻、丹参、郁金、柴胡换成麸炒泽泻、酒丹参、醋郁金、醋柴胡后，以及单煎、混煎的方式对水煎液中18种主要有效成分含量的影响，并结合主成分分析（principal component analysis,PCA）及偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA）化学模式识别方法评价生品混煎组（8味饮片均为生品，混煎下文简写为YH）、生品单煎组（8味饮片均为生品，单煎后混合，下文简写为YD）、炮制混煎组（麸炒泽泻、酒丹参、醋郁金、醋柴胡、海藻、山楂、决明子、水飞蓟，混煎，下文简写为PH）、炮制单煎组（麸炒泽泻、酒丹参、醋郁金、醋柴胡、海藻、山楂、决明子、水飞蓟，单煎后混合，下文简写为PD）间的质量差异，以期为化痰祛湿活血方如何选用药物炮制品、如何煎煮提供一定的参考，从而为明确饮片炮制对方剂功效的影响提供数据支撑，为临床方剂煎煮提供指导。

1 材料与仪器

1.1 材料 泽泻饮片（批号：200403641，200202011，200500691）、丹参饮片（批号：201200631，201100181）、柴胡饮片（批号：200403321，200900911）、山楂饮片（批号：210102511，191203831，190804891）、决明子饮片（批号：191000099，190200099）、郁金饮片（批号：201201391，191001211）、海藻饮片（批号：190601871）均购自康美药业股份有限公司；郁金饮片（批号：200502）购自普宁市泽群中药饮片有限公司；海藻饮片（批号：200801）购自广东天诚中药饮片有限公司；水飞蓟饮片（批号：190501CP0122）购自安国市光明饮片加工厂。上述饮片由河南中医药大学药学院张振凌教授鉴定均为正品，且符合2020年版《中华人民共和国药典》（一部）规定。柴胡皂苷b1（批号：58558-08-0，纯度≥98.0%）、柴胡皂苷b2（批号：58316-41-9，纯度≥98.5%）、芦丁（批号：153-18-4，纯度≥98.0%）、橙黄决明素（批号：67979-25-3，纯度≥98.0%）、橙皮苷（批号：520-26-3，纯度≥98.0%）、金丝桃苷（批号：482-36-0，纯度≥98.0%）、23-乙酰泽泻醇C（批号：26575-93-9，纯度≥98.0%）、绿原酸（批号：327-97-9，纯度≥98.0%）、阿魏酸（批号：1135-24-6，纯度≥98.0%）、丹酚酸B（批号：121521-90-2，纯度≥98.0%）、山柰酚（批号：20736-09-8，纯度≥98.5%）、芦丁（批号：153-18-4，纯度≥98.0%）、丹参酮ⅡA（批号：568-72-9，纯度≥98.0%）、槲皮素（批号：20874-52-6，纯度≥98.5%）、槲皮苷（批号：522-12-3，纯度≥98.0%）、水飞蓟宾（批号：802918-57-6，纯度≥98.0%）、丹参素钠（批号：1135-24-6，纯度≥98.0%）、柚皮素（批号：19885-10-0，纯度≥98.0%）均购自成都普思生物科技股份有限公司。

1.2 仪器 BSA224S-CW I级电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；YP10002 Ⅲ级电子天平（上海横际科学仪器有限公司）；KQ-500DV型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；旋转蒸法系统（上海爱朗仪器有限公司），包括OSB-2100型油浴锅、CA-1115A型冷却水循环装置、隔膜真空泵；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；5424R型低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取1/10处方量的各饮片，浸泡60 min，加12倍水，煎煮3次，30 min/次，合并水煎液，混匀，于60 ℃旋转蒸发仪浓缩，取10 mL置于25 mL容量瓶中，75%甲醇定容，摇匀，滤过，续滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、水飞蓟宾、丹参素钠、橙皮苷、槲皮苷、23-乙酰泽泻醇C、丹酚酸B、金丝桃苷、绿原酸、柚皮素、芦丁、槲皮素、阿魏酸、橙黄决明素、山柰酚、芹菜素、丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇溶解配制成各成分质量浓度分别为0.112、0.123、0.120、0.988、0.145、0.121、0.161、0.243、0.378、0.266、0.239、0.322、0.128、0.158、0.731、0.149、0.237、0.248 mg/mL的对照品溶液。取丹酚酸B对照品溶液1 mL和其他对照品溶液各20 μL配制成混合对照品溶液。

2.2 色谱条件 Eclipse XDS-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-1%磷酸（B），梯度洗脱：0～5 min，5%A～8%A；5～10 min，8%A；10～45 min，8%A～39%A；45～70 min，39%A～41.5%A；70～74 min，41.5%A；74～83 min，41.5%A～48%A；83～93 min，48%A～67.4%A；93～103 min，67.4%A～95%A；103～105 min，95%A～5%A；105～108 min，5%A；柱温：35 ℃；流速：0.9 mL/min；检测波长：265 nm；进样量：5 μL。混合对照品及供试品色谱图见图1。

图1 HPLC 图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液适量，依次稀释至1.000、0.500、0.200、0.100、0.050、0.010、0.001倍的对照品梯度溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，记录各成分的峰面积，以进样质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。各成分在线性范围内线性良好，18个成分相关系数（r）均在0.900 0以上。（见表1）

2.3.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录各成分的峰面积。结果18个待测成分峰面积的RSD在0.54%～1.13%之间，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取化痰祛湿活血方（YH1）供试品，按“2.2”项下色谱条件于0、3、6、9、12、24 h后进样，记录各成分的峰面积。结果18个待测成分峰面积的RSD在0.54%～1.36%之间，表明供试品在24 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 精密称取1/10处方量的化痰祛湿活血方样品（YH1）6份，按“2.1.1”项下方法制备，“2.2”项下色谱条件进样，记录各成分的峰面积。结果18个待测成分峰面积的RSD在1.28%～3.58%之间，表明方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的1/20处方量的化痰祛湿活血方样品（YH1）6份，分别加入各对照品溶液适量（加入后待测物总量相当于1/10处方量样品中含有量），按“2.1.1”项下方法制备，“2.2”项下色谱条件进样，记录各成分的峰面积，计算峰面积的RSD值。结果18个待测成分峰面积的RSD在0.49%～3.51%之间，表明方法准确度良好。（见表2）

表2 18 种成分的加样回收率试验结果 （n=6）

2.4 样品含量测定 精密称取1/10处方量的各饮片，按“2.1.1”项下方法分别制备3批YH、YD、PH、PD样品，按“2.2”项下色谱条件进样，记录各成分的峰面积，并计算各成分的含量。（见表3）炮制前后单煎水煎液中丹参素钠、阿魏酸、橙皮苷、槲皮素、柚皮素、23-乙酰泽泻醇C均高于混煎水煎液，混煎水煎液中绿原酸、芦丁、丹酚酸B、水飞蓟宾、山柰酚、芹菜素、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、丹参酮ⅡA含量均高于单煎水煎液；无论单煎还是混煎，原方绿原酸、阿魏酸、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、23-乙酰泽泻醇C、柴胡皂苷b1、丹参酮ⅡA含量均高于炮制后的组方，炮制后的组方中柴胡皂苷b2含量高于原方。

表3 不同化痰祛湿活血方样品中18 种成分的含量

2.5 聚类分析 建立3批YH、YD、PH、PD化痰祛湿活血方样品的18种成分含量的数据矩阵，导入SPSS 22.0分析软件，采用系统聚类，组间均联，Euclidean距离平方为测度，进行聚类模式识别分析。由聚类分析树状图可知，12个样品分成5类：YH1、YH2为第Ⅰ类，PH1、PH2为第Ⅱ类，PH3、YH3为第Ⅲ类，PD1、PD2、PD3为第Ⅳ类，YD1、YD2、YD3为第Ⅴ类。当欧氏距离小于20时，可分为两类，单煎为第Ⅰ类，混煎为第Ⅱ类。（见图2）

图2 HCA 图

2.6 主成分分析 将3批YH、YD、PH、PD化痰祛湿活血方样品的18种成分含量为变量，导入SIMCA-P+14.1(Demo）软件进行PCA处理，系统自动拟合后选用前2个主成分进行分析，模型检验R2Xcum=0.76，Q2cum=0.494，表明该模型稳定性及预测信度良好，样品分类良好。其中第1个主成分贡献46.2%，代表了原始数据46.2%的信息，说明原始数据之间的差异，46.2%的差异由煎煮方式引起；第2主成分贡献率29.8%，代表了原始数据29.8%的信息，说明原始数据之间的差异，29.8%是由炮制引起的。（见图3）经PCA模型拟合分析得到载荷散点图可知，柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、丹参酮ⅡA、橙皮苷对主成分1贡献较大，绿原酸、柚皮素、金丝桃苷、槲皮苷、23-乙酰泽泻醇C对主成分2贡献较大。（见图4）

图3 PCA 得分图

图4 PCA 载荷散点图

图5 PLS-DA 得分图

2.7 偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA） 在P CA的基础上选择具有监督模式的PLS-DA进行分析，结合评价PLS-DA模型质量的3个关键指标R2Xcum=0.747，R2XYcum=0.569，Q2cum=0.376，说明样品聚类、分离良好。（见图6）

图6 PLS-DA VIP 图

2.8 差异成分分析 为明确炮制前后、单煎及混煎引起差异的质量标志物，采用变量重要性投影（variable importance in the projection,VIP）对数据矩阵分析，建立炮制前后（YH-PH、YD-PD）、不同煎煮方式（YH-YD、PH-PD）的VIP图。VIP＞1，代表具有显著影响。（见图6）

（1）YH-PH中VIP＞1的成分包括：23-乙酰泽泻醇C、槲皮素、丹参酮IIA、芦丁、山柰酚、金丝桃苷、橙皮苷。（见图6A）

（2）YD-PD中VIP＞1的成分包括：柴胡皂苷b2、橙黄决明素、金丝桃苷、23-乙酰泽泻醇C、槲皮素、丹参酮ⅡA、水飞蓟宾、阿魏酸。（见图6B）

（3）YH-YD中VIP＞1的成分包括：柴胡皂苷b2、橙皮苷、槲皮素、芦丁、丹参酮ⅡA、阿魏酸、柴胡皂苷b1、丹参素钠、23-乙酰泽泻醇C、丹酚酸B。（见图6C）

（4）PH-PD中VIP＞1的成分包括：槲皮素、橙皮苷、23-乙酰泽泻醇C、柴胡皂苷b2、橙黄决明素、芹菜素、山柰酚、丹参酮ⅡA、水飞蓟宾、阿魏酸、柴胡皂苷b1。（见图6D）

3 讨 论

金丝桃苷、芦丁、橙皮苷、槲皮苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚、芹菜素为黄酮类化合物，具有显著的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理活性[13]；阿魏酸、绿原酸为苯丙酸类化合物，具有抗氧化、抗血栓、降血脂、抗肿瘤等药理活性[14-15]；丹参素钠为丹参素的钠盐结构，功效与丹参素一样；丹参素与丹酚酸B、丹参酮ⅡA为丹参的主要活性成分，对NASH有一定的治疗的作用[16-18]；水飞蓟宾为水飞蓟的主要活性成分，具有良好的保护肝脏和清除自由基作用[19]；橙黄决明素为决明子主要有效成分，具有较好的降血脂、抗动脉粥样硬化作用[20]；23-乙酰泽泻醇C为三萜类成分，是泽泻主要有效成分之一，具有利尿、降血脂、保肝、抗炎、抗氧化等作用[21]；柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分，具有抗炎、免疫调节、保护肝细胞、抑制肝纤维化等作用[22]。本试验通过HPLC法建立了同时测定化痰祛湿活血方中丹参素钠、绿原酸、阿魏酸、金丝桃苷、芦丁、橙皮苷、槲皮苷、丹酚酸B、槲皮素、柚皮素、水飞蓟宾、山柰酚、芹菜素、橙黄决明素、23-乙酰泽泻醇C、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、丹参酮ⅡA等18种主要有效成分的含量测定方法，方法稳定、可靠。

本研究对炮制前后、不同煎煮方式的化痰祛湿活血方进行聚类分析发现样品聚类良好，说明样品间差异较大，炮制、煎煮方式对化痰祛湿活血方影响较大。为进一步阐释差异成分，本研究分别对炮制前后、单煎和混煎的样品进行分析，发现23-乙酰泽泻醇C、槲皮素、丹参酮ⅡA、芦丁、山柰酚、金丝桃苷、橙皮苷可能是引起YH、PH的差异成分；柴胡皂苷b2、橙黄决明素、金丝桃苷、23-乙酰泽泻醇C、槲皮素、丹参酮ⅡA、水飞蓟宾、阿魏酸可能是引起YD、PD的差异成分。两组样品组成相同而煎煮方式不同，故芦丁、山柰酚、橙皮苷、柴胡皂苷b2、橙黄决明素、水飞蓟宾、阿魏酸可能是不同煎煮方式的差异成分。基于YH、YD分析，柴胡皂苷b2、橙皮苷、槲皮素、芦丁、丹参酮ⅡA、阿魏酸、柴胡皂苷b1、丹参素钠、23-乙酰泽泻醇C、丹酚酸B可能是引起YH、YD的差异成分；基于PH、PD分析，槲皮素、橙皮苷、23-乙酰泽泻醇C、柴胡皂苷b2、橙黄决明素、芹菜素、山柰酚、丹参酮ⅡA、水飞蓟宾、阿魏酸、柴胡皂苷b1可能是引起PH、PD的差异成分。两组样品煎煮方式相同，样品不同，故芦丁、丹参素钠、丹酚酸B、橙黄决明素、芹菜素、山柰酚、水飞蓟宾的差异可能是由炮制因素造成的。

本试验建立了不同炮制品组方、不同煎煮方式的化痰祛湿活血方的18种有效成分的含量测定方法，并通过HCA、PCA、PLS-DA初步分析了影响不同炮制、煎煮方式的化痰祛湿活血方的差异标志性成分。实验结果能够较为全面地探讨不同炮制、煎煮方式对化痰祛湿活血方的影响。但中药复方化学成分复杂，本研究仅对识别的18种成分进行分析，不够深入，后期可加强对其他化学成分的识别，并跟踪体内代谢过程，通过比较入血成分含量、组织分布、代谢等情况探讨炮制、煎煮方式对中药复方在体内外的影响，从而为中药炮制理论、临床药效提供依据。