马泽冰，李汪洋，熊 辉

（1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.湖南省中医骨伤临床医学研究中心，湖南 长沙 410007）

桃红四物汤出自清代吴谦所著的《医宗金鉴》，为“活血化瘀”的代表方剂。骨折早期骨断筋伤、血溢脉外、气血凝滞而致“血瘀证”。因此，骨折早期予桃红四物汤最为相宜。研究[1-2]证实，骨折早期服用桃红四物汤能明显缩短骨折愈合时间，提高骨折修复效率。目前，关于桃红四物汤促进骨折愈合的物质基础及作用靶点不甚清楚。中药复方具有多层次、多效应、多靶点的特点，从细胞和分子水平研究其药效物质基础和作用机制存在一定困难[3]。而网络药理学可为中药复方研究提供新的研究思路和解决办法[4]。

中药复方的网络药理学研究过程包括5个步骤[5]：（1）识别中药复方的有效活性成分；（2）识别中药复方中活性成分的作用靶点；（3）识别中药复方治疗疾病的相关基因；（4）构建可视化的“成分-基因-疾病”关联网络；（5）建立化合物与关键标靶分子对接模型。鉴于网络药理学在中药复方研究的优势，本研究将通过此方法预测桃红四物汤促进骨折愈合的药效物质基础及作用靶点，并通过建立大鼠右侧股骨干骨折模型，对核心靶点进行实验验证。

1 材料与方法

1.1 桃红四物汤活性化学成分筛选 桃红四物汤由生地黄、当归、赤芍、川芎、桃仁、红花6味中药组成，在TCMSP数据库[6]（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分析平台中分别输入“生地黄”“当归”“赤芍”“川芎”“桃仁”“红花”，检索全部化学成分。根据药代动力学特征，活性分子具有较好的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药性（drug-likeness，DL），以OB≥30%和DL≥0.18筛选，获得桃红四物汤的活性化合物。

1.2 活性化合物靶基因的获取 在TCMSP数据库中分别检索桃红四物汤活性化合物的靶基因。通过UniProt数据库[7]（https://www.uniprot.org/）对靶基因标准化，获得基因简称（gene symbol）。

1.3 股骨干骨折疾病基因的筛选 在GeneCards[8]（https://www.genecards.org/）数据库输入关键词“femoral shaft fracture”，获得股骨干骨折疾病基因，以相关系数（Score）≥4为过滤条件。

1.4 桃红四物汤治疗股骨干骨折潜在靶点的筛选 通过Venny2.1软件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对活性化合物靶基因和股骨干骨折疾病基因进行映射，确定桃红四物汤治疗股骨干骨折的靶点。将靶基因导入String数据库[9]（https://string-db.org），物种为“homo sapiens”，将“minimum required interaction score”设置为0.9，获得蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）网络。应用count.R软件确定靶蛋白出现的频次。

1.5 “药物-成分-基因-疾病”网络的构建 Cytoscape为构建可视化网络的生物信息分析软件，其核网络中每个节点（node）之间的连线（edge）代表分子间的相互作用[10]。把活性化合物、活性化合物靶基因、疾病基因导入Cytoscape 3.6.0中，构建“药物-成分-基因-疾病”的网络。

1.6 活性化合物与关键靶标的分子对接 使用分子对接技术进行虚拟对接，研究桃红四物汤的化合物活性成分与治疗股骨干骨折的相关靶标，说明活性成分与靶标蛋白作用机制的结合作用。采用Autodock 4.2.6进行虚拟对接，运行PyMOL 2.2.0、Discovery Studio Client v19.1.0软件进行可视化分析。

1.7 实验验证

1.7.1 实验动物 5周龄SPF级雄性SD大鼠24只，体质量（120±10）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号：430727221100472812。饲养于湖南中医药大学动物实验中心SPF级实验室，动物使用许可证号：SYXK（湘）2019-0009。饲养条件：室温（22±2）℃，相对湿度（60±10）%，12 h昼12 h夜循环，灭菌饲料喂养，自由摄食和饮水。本实验通过湖南中医药大学动物实验中心伦理委员会审查（LL20191010001）。

1.7.2 药物与试剂 桃红四物汤方药组成：生地黄20 g，当归20 g，赤芍20 g，川芎10 g，桃仁20 g，红花10 g。生地黄（产地：河南，批号：NY2001902）、当归（产地：甘肃，批号：NG19121701）、赤芍（产地：四川，批号：NG19122401）、川芎（产地：四川，批号：SL19112207）、桃仁（产地：新疆，批号：2019070204）、红花（产地：新疆，批号：HY19121803）均购于湖南中医药大学第一附属医院，并经鉴定符合2020年版《中华人民共和国药典》规定。按照成方比例称取桃红四物汤生药材300 g，水煎两次，定容，制备成生药质量浓度为2.4 g/mL的汤剂，-20 ℃保存备用。苏木素染液（批号：G1004）购于武汉赛维尔生物科技有限公司；伊红染液（批号：17372-87-1）购于上海晶莱生物技术有限公司；中性树胶（批号：G8590）购于索莱宝生物技术有限公司；二甲苯（批号：1330-20-7）购于国药集团化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸EDTA（批号：2015034）购于上海生工生物工程股份有限公司；血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）兔抗体（批号：ab46154）、β-actin（批号：ab8227）、羊抗兔二抗（批号：ab6721）均购于英国Abcam公司；显影液（批号：BW-61）购于上海市佳信科技有限公司。

1.7.3 主要仪器 Multix Select DR型X-Ray（上海西门子医疗器械有限公司）；BA410T型显微镜（四川Motic公司）；BMJ-A型包埋机（常州中威电子仪器有限公司）；YD-315型切片机（浙江金华益迪公司）；DYY-6C型恒温箱（北京六一生物科技有限公司）；RV-211M型旋转蒸发仪（上海恒一精密仪器有限公司）；TS-92型摇床（江苏其林贝尔仪器制造有限公司）；H1650R型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪仪器有限公司）；YT-CJ-2NB型超净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司）；Donatello型脱水机（意大利DIAPATH公司）。

1.7.4 分组与造模 将24只大鼠随机分为模型组、桃红四物汤低剂量组、桃红四物汤中剂量组、桃红四物汤高剂量组，每组6只。所有大鼠均采用右侧股骨干骨折造模法[11]制备模型大鼠，即大鼠麻醉后仰卧于无菌台，右侧大腿外侧做2 cm纵向切口，可见大腿外侧白色股骨前侧肌群与后侧肌群深筋膜联合线；沿此处分离肌肉后拉钩充分暴露视野，显露股骨干后，使用迷你电摩机予股骨干中段横向截断；以股骨干大小合适克氏针逆行于断端处插入，并向近端推穿至股骨大转子顶部。复位骨折后，克氏针远端推至股骨髁间处，并折断多余克氏针，断端埋于皮下，后75%乙醇消毒后缝合皮肤。（见图1）

图1 模型制备过程图

1.7.5 实验药物 大鼠的给药剂量（D/g），由人与动物体表面积（A/m2）换算公式[12]，D大鼠=D人×A大鼠/A人。根据Meeh-Rubner公式，A=K×（W2/3）/10.000，W大鼠=120 g，W人=70.000 g，K为系数（大鼠=9.1；人=10.6），D人=100 g，A大鼠/A人=0.012 29，D大鼠=100×0.012 29≈1.2 g。将成人临床等效剂量1.2 g（生药材）定为本实验的中剂量，以2倍浓度梯度分别增设低剂量和高剂量，各浓度剂量为：低剂量=5 g/kg；中剂量=10 g/kg；高剂量=20 g/kg。桃红四物汤低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予5、10、20 g/（kg·d）桃红四物汤，模型组大鼠灌胃给予等量蒸馏水。术后第1天开始灌胃，2次/d，连续5 d。

1.7.6 观察指标

1.7.6.1 大鼠股骨干组织病理学观察 第21天，分别采集4组大鼠右侧股骨干骨折标本，经4%多聚甲醛固定后，将骨标本进行常规脱钙。以骨折端为中心，取长约5 mm骨痂石蜡包埋、制作成厚度约4 μm切片。行HE染色和Masson 染色后，在显微镜下观察，拍照。

1.7.6.2 Western blotting法检测大鼠股骨干VEGF蛋白相对表达量 第5天采集右侧股骨干骨折标本，以骨折端为中心，取长约5 mm骨痂，液氮下研磨成粉末状，称重后移入1.5 mL的EP管中，分别加入蛋白裂解液PIPA（7 μL/mg）和蛋白酶抑制剂PMSF（10 μL/mL），冰浴30 min，震荡均匀，15 000 r/min（离心半径为8.5 cm）离心5 min。取上清液0.5 mL移入EP管中，BCA法计算蛋白浓度。上样，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电压160 V，60 min；硝酸纤维素膜（0.45 μm）转膜，电流300 mA，60 min；室温封闭40 min，血管内皮生长因子（VEGF）兔抗体（1∶5 000）4 ℃孵育过夜，β-actin为内参（1∶200）；次日，抗兔二抗（1∶3 000）室温孵育60 min后，显色并检测VEGF蛋白相对表达量。

1.7.7 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。计量资料均采用“均数±标准差”表示。若各组数据均满足正态分布及方差齐性时，采用单因素方差分析，采用LSD分析进行多重比较；若方差不齐，采用Dunnett's T3分析。不符合正态分布时，进行秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 桃红四物汤活性化合物成分筛选 经检索共得到764个化合物，其中生地黄76个，当归125个，赤芍119个，川芎189个，桃仁66个，红花189个。满足OB≥30%，共有367个活性化合物，同时满足OB≥30%和DL≥0.18，共有85个活性化合物。（见表1）

表1 桃红四物汤中活性化合物的分布

2.2 桃红四物汤标靶基因筛选 从TCMSP数据库中检索桃红四物汤中活性化合物的靶基因，删除无标靶基因的活性化合物，共获得44个活性化合物，对应111个基因。（见表2）

2.3 股骨干骨折疾病基因靶点的筛选 在GeneCards数据库中共检索到897个与股骨干骨折相关的疾病靶点。按照相关系数≥4，得到394个疾病靶基因。使用Venny2.1绘制韦恩图，将这394个疾病靶基因与桃红四物汤的靶基因做交集。最终得到的28个共同靶基因可能为桃红四物汤治疗股骨干骨折的潜在作用靶点。（见图2）

图2 桃红四物汤靶点与股骨干骨折靶点韦恩图

2.4 “药物-成分-基因-疾病”网络的构建 28个靶基因对应14个活性化合物，即川芎哚、β-谷甾醇、黄芩苷、鞣花酸、儿茶酸、花旗松素、芍药苷、杨梅酮、叶酸、檞皮素、β-胡萝卜素、山柰酚、赤霉素87、自由酸。（见表3）将桃红四物汤中活性化合物与股骨干骨折靶基因导入Cytoscape 3.6.0，构建“桃红四物汤-成分-基因-股骨干骨折”可视化网络。（见图3）

表3 桃红四物汤中活性化合物与对应靶基因

2.5 构建PPI网络及获取关键靶标 通过STRING数据库建立靶标蛋白之间相互作用的网络，将“minimum required interaction score”设置为0.9构建PPI网络。（见图4）共得到28个节点，118条边，平均节点数为8.43，平均局部聚集指数为0.675。以所有靶点的节点“degree”为参考，“degree”越大说明该靶蛋白越重要，其中血管内皮生长因子（VEGF）节点度值最高。（见表4）此外，通过STRING数据库统计发现VEGF与其他18个蛋白有作用关系。据此，推测VEGF可能为桃红四物汤治疗股骨干骨折的关键靶点。（见表5）

表4 桃红四物汤与股骨干骨折共同靶点的节点度值

表5 VEGF 与其他靶点之间的相互作用

图4 桃红四物汤治疗股骨干骨折潜在靶点的PPI 网络

2.6 活性化合物-关键靶基因分子对接 通过上述分析得出VEGF为桃红四物汤治疗股骨干骨折的关键靶点，其中β-胡萝卜素、黄芩苷与VEGF具有结合活性，同时β-胡萝卜素与黄芩苷为桃红四物汤治疗股骨干骨折的核心活性化合物。因此采用Autodock 4.2.6将化合物β-胡萝卜素、黄芩苷与VEGF关键靶标进行虚拟对接，对接过程中只改变配体的构象，而保持蛋白构象不变，其余所有参数均采用默认值。对接结果通过PyMOL 2.2.0，Discovery Studio Client v19.1.0软件进行可视化分析。结果显示，VEGF与β-胡萝卜素对接后可与HIS20、ILE22、LEU25、PRO33形成氢键作用力，且形成氢键作用力越多结合越稳定。（见图5a）VEGF与黄芩苷对接后可与TYR38、GLY81形成氢键作用力。（见图5b）

图5 VEGF 与β-胡萝卜素、黄芩苷分子对接可视化分析

图6 骨折21 d 后各组大鼠股骨干病理切片图

2.7 各组大鼠股骨干病理学改变情况 100倍镜下观察显示：模型组大鼠骨标本可见骨痂内软骨面积（M）较大，类骨质无明显增加。与模型组比较，桃红四物汤低、中、高剂量组大鼠骨痂内软骨面积（M）明显缩小，且呈剂量依赖性，类骨质增加。400倍镜下观察显示：模型组大鼠骨痂内以软骨细胞为主，呈不同凋亡状态，可见散在的成软骨细胞及周围软骨基质；桃红四物汤低剂量组大鼠骨痂内以软骨细胞为主，可见少量的成骨细胞；桃红四物汤中剂量组大鼠骨痂内以成骨细胞为主，未见软骨细胞，可见少许的骨细胞；桃红四物汤高剂量组大鼠骨痂内可见大量成骨细胞，在骨痂周边的成骨细胞被基质包埋形成骨陷窝，转化为静止期的骨细胞。桃红四物汤干预后，肥大的软骨细胞向成骨细胞转化增强，软骨细胞凋亡加快，胶原纤维分泌增加，骨痂骨化进程明显加快，以桃红四物汤高剂量组最明显。

2.8 各组大鼠早期骨痂内VEGF蛋白相对表达量比较 与模型组比较，桃红四物汤中、高剂量组大鼠早期骨痂内VEGF蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.05），其中高剂量桃红四物汤作用最为显著；桃红四物汤低剂量组大鼠早期骨痂内VEGF蛋白相对表达量与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。（见表6、图7）

表6 各组大鼠早期骨痂内VEGF 蛋白相对表达量比较（±s）

表6 各组大鼠早期骨痂内VEGF 蛋白相对表达量比较（±s）

注：与模型组比较，aP＜0.05。

组别 n VEGF/β-actin模型组 6 0.566±0.050桃红四物汤低剂量组 6 0.686±0.080桃红四物汤中剂量组 6 0.973±0.140a桃红四物汤高剂量组 6 1.087±0.111a F 18.210 P 0.002

图7 各组大鼠早期骨痂内VEGF 蛋白表达Western blotting 图

3 讨 论

桃红四物汤以桃仁、红花为主药，突出其活血化瘀之旨；辅以血中之血药的生地黄、赤芍，以及血中之气药的当归、川芎，调畅气血，以助活血化瘀之功。本方活血不伤正，为“活血化瘀”之平剂，主治“血瘀证”。骨折早期，骨断筋伤，络脉受损，血溢脉外，离经之血瘀滞于肌肤腠理而致血瘀证。桃红四物汤活血化瘀最为相宜。后世历代伤科专著所载众多治伤名方，多随此方加减化裁，为活血化瘀法治疗骨折的代表方剂。

网络药理学作为新兴分支学科，可系统地对中药复方中的活性化合物及其作用靶点进行预测。本研究筛选桃红四物汤促进股骨干骨折愈合的14个活性化合物，包括β-谷甾醇、黄芩苷、鞣花酸、儿茶素、川芎哚、山柰酚、杨梅酮、芍药苷、叶酸、槲皮素、β-胡萝卜素、自由酸、赤霉素87、花旗松素。这些化合物靶向VEGF、IL6、TP53、JUN、CTNNB1、TNF、TGFB1、ALB、CASP3、ESR1、MMP9、PPARG、FOS、AR、CAV1、IGF2、MMP2、HIF1、AF3、CAT、F2、NOS2、BCL2、ESR2、GJA1、CA2、CDKN1B、IFG2R等28个基因。本研究对这些靶基因进行蛋白交互作用分析发现，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）与其他18个蛋白存在相互作用，处于整个蛋白网络的核心，为桃红四物汤促进股骨干骨折愈合的关键靶点。基于中药数据库分析，黄芩苷和β-胡萝卜素可直接靶向VEGF。有研究表明，β-胡萝卜素能增加VEGF的水平[13]，并促进血管新生[14]。大量临床循证研究报道，β-胡萝卜素能保护中老年人髋部骨折[15]，增加血清β-胡萝卜素，降低骨折的风险[16]。此外，黄芩苷可通过增加microRNA-217的表达，增强成骨细胞活性，促进成骨细胞分化[17]，并调节雌激素受体信号通路的表达和血管新生[18]。因此，黄芩苷和β-胡萝卜素可能是桃红四物汤促进股骨干骨折愈合的关键活性化合物。

骨折早期的炎症反应是启动骨折愈合的首要因素。骨组织受到损伤后，局部缺血和缺氧造成血管通透性增加，释放大量细胞因子，刺激细胞从骨髓或外周组织动员并迁移至损伤区域，启动骨折的修复过程[19]。前期研究通过设置阳性对照组已证明桃红四物汤早期干预可以促进骨折愈合[20-21]，且本研究为探究桃红四物汤促进骨折的作用机制，故未再次设置阳性对照组。本研究建立右侧股骨干骨折大鼠模型，以桃红四物汤在早期连续干预骨折大鼠5 d后，发现桃红四物汤中、高剂量组大鼠早期骨痂内VEGF蛋白相对表达量明显升高，具有剂量依赖性。从组织学上观察，桃红四物汤能促进骨痂内软骨细胞大量凋亡，使成骨细胞增多，骨基质分泌增加，且药物剂量越高其作用越显著。因此，骨痂内VEGF可能是桃红四物汤促进股骨干骨折愈合的核心靶点。

骨折愈合是骨形成与血管生成相互作用的过程。VEGF是血管形成的关键生长因子，能在骨折早期促进血管内皮细胞的增殖和迁移，诱导已有血管的再生（血管新生）和新血管的生长（血管发生）[22]。VEGF还能扩张骨髓内窦状毛细血管[24]和增加黏着斑和应力纤维的数目[23]，促进炎症期骨髓间充质干细胞归巢至骨痂处参与骨再生。此外，新生的血管通过分泌骨形成因子诱导间充质干细胞向成骨细胞分化[24]，而间充质干细胞及分化后的成骨细胞可通过分泌VEGF促进血管新生，使得VEGF在骨折早期修复过程中启动血管生成并调控骨形成，将血管新生和成骨耦联[25-26]。因此，VEGF可能为加速股骨干骨折愈合的核心靶点[27]。

本研究应用网络药理学的预测和右侧股骨干骨折大鼠模型的验证，发现桃红四物汤促进股骨干骨折愈合的14个潜在靶点并验证了VEGF为促进股骨干骨折愈合的关键靶点。同时，黄芩苷和β-胡萝卜素可直接靶向VEGF，可能为桃红四物汤促进股骨干骨折愈合的关键活性成分。