赵仕博，赵永烈，邓硕秋，张平安，林婧婧，郭 丛，刘 安，刘晓谦，易 红，

（1.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700）

偏头痛是一种以单侧或双侧搏动性头痛为典型特征的慢性神经血管功能紊乱性疾病[1]，可反复发作，迁延不愈。2021年公布的世界范围疾病负担统计表明，偏头痛属于全世界第六大常见疾病，位列全球致残性疾病第2位，在中国排第5位[2]，是年龄低于50岁人群致残的首要因素，给社会造成了沉重的负担[3]。偏头痛的病因病机复杂，发病机制仍未完全阐明[4-5]。目前认可度较高的学说有三叉神经血管反射学说[6]、皮质扩展性抑制学说[7]等。中医学认为偏头痛属于“头痛”“头风”“偏头风”等范畴，病程较长，缠绵难愈。各种致病因素均可导致脉络阻滞不通，不通则痛。研究表明，瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）、谷氨酸受体5（mGluR5）及血管活性物质[如5-羟色胺（5-HT）、内皮素-1（ET-1）、降钙素基因相关肽（CGRP）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（iNOS）等]在偏头痛发作过程中扮演着重要的角色[8]。

偏头痛治疗以口服药为主，但近年来鼻内疗法更受青睐，展现出良好前景[9]。鼻内疗法多使用塞、滴、搐、嗅等法使药物经鼻腔吸收以治疗疾病[10]。现代解剖学研究显示药物经鼻入脑主要通过嗅觉通路、三叉神经通路起效[11]，具有起效快、避免肝脏首过效应、快速穿过血脑屏障、操作简便等优点，非常适于急救、自救及疾病发作时的中止性治疗。鼻内疗法可通过调节血管舒缩、调控痛觉通路、减少氧化应激等改善偏头痛症状[12]，国际头痛学会建议使用鼻内制剂治疗偏头痛急性发作[13]。

“一粒金”最早出自朱丹溪《丹溪心法》，是朱丹溪唯一明确提出用于治疗偏头痛的方剂。明代医家万表将原方中的青黛去掉，在《万氏济世良方》中记为一粒金搐鼻方。组成为荜茇、藁本、延胡索、白芷、川芎。同时万表提出以“出涎为度”的临床用药心得[14]。目前缺乏该方活性成分及作用机制的系统研究。而网络药理学具有系统性、相关性和预测性的特点，与中药方剂组分复杂性相吻合，因此本研究基于网络药理学研究一粒金（YLJ）经鼻给药对大鼠偏头痛模型的作用，旨在为临床应用及新药开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 网络药理学研究

1.1.1 一粒金活性成分及作用 通过中医药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)检索川芎、荜茇、白芷、藁本、延胡索的化学成分，以口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%和类药性（drug-likeness,DL）≥0.18作为筛选指标，筛选出一粒金包含的活性成分。通过TCMSP及成分靶点预测数据库（Swiss Target Prediction，http：//www.swisstargetprediction.ch/）检索和预测潜在作用靶点，借助数据库将蛋白质靶点名称转化为基因名。

1.1.2 偏头痛相关靶点筛选 以“migraine”“migraine headache”为关键词，从基因名片数据库（Gene Cards，https：//www.genecards.org）、OMIM 数 据 库（https://www.omim.org/）、UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）、TTD数据库（http://db.idrblab.net/ttd/）进行靶点检索。将所有筛选结果进行汇总、去重，得到偏头痛相关靶点。

1.1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建及核心靶点筛选 将“1.1.1”中活性成分的作用靶点与偏头痛相关靶点取交集，绘制韦恩图。将药物-疾病交集靶点输入STRING平台（https：//string-db.org），设置物种为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设置为Medium confidence（0.4），构建PPI网络。将PPI网络结果导入Cytoscape 3.9.0软件中，计算度值（DC）、介数中心性（BC）、接近中心性（CC），以上述拓扑参数的中位数为标准筛选核心靶点。

1.1.4 基因本体（GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 利用DAVID数据库对核心靶点进行GO富集分析与KEGG通路富集分析，筛选条件为P＜0.05，对富集结果进行可视化分析。

1.2 动物实验

1.2.1 实验动物 8周龄SPF级健康雄性SD大鼠60只，体质量（200±20）g，购于维通利华（北京）有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2021-0011。所有动物饲养于中国中医科学院中药研究所动物室，普通饮食、饮水，温度（22±1）℃，湿度（65±5）%，12 h昼夜循环光环境，适应性喂养5 d。本实验已通过中国中医科学院中药研究所实验动物伦理委员会批准，伦理批件号：2022B182。

1.2.2 药物与试剂 川芎（批号：2101056）、延胡索（批号：2012001）、藁本（批号：2101007）均购于北京市双桥燕京中药饮片厂；荜茇（批号：22012703）、白芷（批号：20112207）均购于北京人卫中药饮片有限公司。中药由易红研究员鉴定均为正品。佐米曲普坦（1 mL∶5 mg，山东京卫制药有限公司，批号：20100192）；硝酸甘油注射液（广州白云山明兴制药有限公司，批号：H44020569）。

降钙素基因相关肽（CGRP）ELISA检测试剂盒（批号：20230222）、一氧化氮（NO）ELISA检测试剂盒（批号：20230222）、一氧化氮合酶（iNOS）ELISA检测试剂盒（批号：20230222）、内皮素1（ET-1）ELISA检测试剂盒（20230222）、5-羟色胺（5-HT）ELISA检测试剂盒（20230222）、瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）ELISA检测试剂盒（20230222）均购于南京建成生物工程研究所。第一代逆转录预混液RT-Mix（两步法）（批号：GPL001N）购于北京金普来生物科技有限公司；Hieff UNICONUniversal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（批号：H6201090）购于翌圣生物科技（上海）股份有限公司；实验所用引物均购自上海生工生物工程有限公司。

1.2.3 主要仪器 YLS-12A型鼠尾光照测痛仪（济南益延科技发展有限公司）；KZ-II型高速组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；Spectramax i3x型多功能酶标（Molecular Devices）；Tadvanced型PCR仪（AnalytikjenaBiometra）；qTowel-3G型实时荧光定量PCR仪（Analytikjena）；HeraeusFresco 21R型台式高速冷冻离心机（Thermo Fisher）。

1.2.4 滴鼻液制备 中药饮片加水煎煮2次，取药液浓缩干燥，即得提取物，依据预实验结果和课题组前期研究结果确定给药剂量，临用前配置生药质量浓度分别为0.5、1.0、2.0 g/mL的一粒金滴鼻液。佐米曲普坦鼻喷雾剂临用前依据临床等效剂量换算公式，使用注射用生理盐水稀释10倍（0.5 mg/mL）。

1.2.5 动物分组 60只大鼠，适应性喂养5 d后，借助鼠尾光热测痛仪测定基线。根据痛阈基线随机分为6组，即对照（NC）组、模型（Model）组、一粒金低剂量（YLJ低剂量）组、一粒金中剂量（YLJ中剂量）组、一粒金高剂量（YLJ高剂量）组、佐米曲普坦（Zol）组，每组10只。

1.2.6 动物偏头痛模型建立及给药 除NC组外，其余各组大鼠参照文献[15]建立慢性偏头痛模型，即于第1、3、5、7、9天，颈背部皮下注射硝酸甘油（10 mg/kg）。模型成功标准：大鼠出现持续至少30 min的双耳发红、烦躁不安、爬笼次数增多、四肢频繁挠头等现象，活动减少、蜷卧。NC组颈部皮下注射等量生理盐水。

除NC组外，佐米曲普坦组（0.225 mg/kg，临床等效剂量）、YLJ低剂量组（0.5 g/mL）、YLJ中剂量组（1.0 g/mL）、YLJ高剂量组（2.0 g/mL）大鼠颈背部皮下注射等量硝酸甘油后立刻滴鼻相应药物，给药量均为50 μL。NC组、Model组鼻腔滴注等量生理盐水。

1.2.7 标本采集 第11天腹主动脉取血后心尖灌流预冷的生理盐水，灌流后取脑组织并分离大脑皮层、延髓。

1.2.8 观察指标

1.2.8.1 大脑皮层NO、iNOS、5-HT、ET-1、CGRP、TRPV1含量 第11天采用1%戊巴比妥钠（100 mg/kg）对大鼠进行腹腔注射麻醉，麻醉后于心尖灌流预冷的生理盐水，取脑组织，分离大脑皮层组织，制10%匀浆，收集上清液。严格按照ELISA试剂盒说明书操作检测大脑皮层中NO、iNOS、5-HT、ET-1、CGRP、TRPV1水平。

1.2.8.2 TRPV1mRNA、mGluR5 mRNA表达水平 使用TRIzol分别提取大脑皮层、延髓部位的总RNA，反转录合成cDNA并进行实时定量PCR反应，检测TRPV1 mRNA、mGluR5 mRNA表达水平，以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法，计算得到目标mRNA相对表达量。所用引物序列见表1。

表1 PCR 引物序列

1.2.9 统计学方法 采用SPSS 26.0软件对数据进行处理，计量资料符合正态分布以“均数±标准差”（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 网络药理学结果

2.1.1 一粒金靶点和偏头痛疾病相关靶点的收集 分别获得川芎活性成分7个，靶点1 371个；荜茇活性成分15个，靶点671个；延胡索活性成分49个，靶点1 549个；白芷活性成分22个，靶点1 408个；藁本活性成分1个，靶点662个。（见表2）去重后一粒金活性成分的靶点基因共计372个。

表2 部分中药活性成分

2.1.2 一粒金治疗偏头痛靶点关系互作分析 检索获得偏头痛疾病靶点共2 346个。一粒金活性成分与偏头痛疾病靶点共有195个共有靶点，即重要靶点。（见图1）

图1 一粒金与偏头痛交集靶点韦恩图

将195个重要靶点的基因ID导入STRING数据库进行PPI分析，使用Cytoscape 3.9可视化，获得177个节点，1 418个节点边。节点的颜色和大小反映度值，节点越大，度值越大，边缘的颜色和线条粗细与度值相关。计算3个拓扑指标的中值，得到69个核心目标。（见图2）AKT1、IL-18、VEGFA、TRPV1等即为关键靶点。

图2 一粒金治疗偏头痛靶点关系互作分析

2.1.3 一粒金治疗偏头痛关键靶点GO分析 利用DAVID数据库对69个核心靶点进行GO分析，获得一粒金治疗偏头痛相关生物学注释以及相关通路。共收集了34种生物过程（biological process，BP）、43种细胞组分（cellular component，CC）和70种分子功能（molecular function，MF）（P＜0.05）。（见图3）一粒金在肿瘤坏死因子产生的正向调控、外周神经系统开发、炎症反应中细胞因子产生的正向调节等方面有良好作用。

图3 一粒金治疗偏头痛关键靶点GO 分析

2.1.4 关键靶点KEGG分析 通过DAVID 6.8数据库对核心靶点进行KEGG富集分析。共得到155条路径（P＜0.05）。一粒金治疗偏头痛的KEGG通路包括癌症通路、PI3K/AKT通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17通路、HIF1通路、MAPK通路等。（见图4）

图4 一粒金治疗偏头痛关键靶点KEGG 分析

2.1.5 一粒金-偏头痛-关键靶点-通路网络构建 将相关数据传入Cytoscape 3.9软件，生成一粒金组方中药-关键靶点-通路网络图，进一步筛选度值＞7的关键靶点进行作图。（见图5）其中绿色菱形节点为一粒金组成中药，黄色圆形节点为度值＞7的关键靶点，蓝色三角形节点为由关键靶点富集得到的通路。该网络由131个节点和2 622条边组成，节点越大度值越大。川芎、延胡索度值最大，靶点中度值最大的为PTGS2、MAPK1、ABCB1、AKT、BCL2、BDNF、CASP3、CCL2、EGFR、ICAM1、IL1B，重要通路包括Toll样受体通路、HIF1通路、IL-17通路、JAK-STAT通路、TNF通路、MAPK通路等。

图5 一粒金-偏头痛-关键靶点-通路网络构建

2.2 动物实验结果

2.2.1 各组大鼠大脑皮层NO、iNOS、ET-1、5-HT水平比较Model组大鼠大脑皮层NO、iNOS、ET-1水平高于NC组（P＜0.01），5-HT水平低于NC组（P＜0.01）；YLJ低剂量组、YLJ中剂量组、YLJ高剂量组、Zol组大鼠大脑皮层iNOS、ET-1水平均低于Model组（P＜0.01）；YLJ低剂量组大鼠大脑皮层NO、5-HT水平与Model组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；YLJ中剂量组、YLJ高剂量组、Zol组大鼠大脑皮层NO水平均低于Model组，5-HT水平均高于Model组，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。（见图6）

2.2.2 各组大鼠大脑皮层CGRP、TRPV1水平比较 Model组大鼠大脑皮层CGRP、TRPV1水平高于NC组（P＜0.01）；YLJ低、中剂量组大鼠大脑皮层CGRP、TRPV1水平与Model组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；YLJ高剂量组、Zol组大鼠大脑皮层CGRP、TRPV1水平均低于Model组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见图7）

图7 各组大鼠大脑皮层CGRP、TRPV1 水平比较（±s，n=10）

2.2.3 各组大鼠大脑皮层和延髓中mGluR5 mRNA、TRPV1 mRNA相对表达量比较 Model组大鼠大脑皮层和延髓中mGluR5 mRNA、TRPV1 mRNA相对表达量高于NC组（P＜0.05或P＜0.01）；YLJ低剂量组大鼠大脑皮层和延髓中mGluR5 mRNA、TRPV1 mRNA相对表达量与Model组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；YLJ中剂量组、YLJ高剂量组、Zol组大鼠大脑皮层和延髓中mGluR5 mRNA、TRPV1 mRNA相对表达量均低于Model组，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。（见图8～9）

图8 各组大鼠大脑皮层中mGluR5 mRNA、TRPV1 mRNA相对表达量比较 （±s，n=10）

图9 各组大鼠延髓中mGluR5 mRNA、TRPV1 mRNA相对表达量比较 （±s，n=10）

3 讨 论

偏头痛可由视觉、嗅觉等因素诱发，多起病急，发作快[16]，与中医理论风邪致病情况一致。风善行而数动，易袭阳位。偏头痛主要致病因素为风邪。后世众多医家对一粒金进行实践运用并加以改良，最终确定以川芎、荜茇、白芷、延胡索、藁本为组方。方中君药荜茇为大辛大热之品，是治疗头痛、鼻渊、牙痛要药[17]。川芎上走头目且通络止痛，可治诸经头痛[18]。白芷散风除湿，藁本祛风散寒，延胡索活血散瘀。三药共为佐药。诸药合用，共奏活血行气止痛之功。现代药理学研究证实白芷、延胡索不仅具有调节中枢神经、抗炎等作用，还具有不良反应少、无成瘾、镇痛持久等优点[19]。白芷水煎液可降低大鼠血清和脑组织中5-HT含量，提示白芷可能通过神经活性配体-受体和5-HT能突触通路，下调5-HT的含量，从而改善偏头痛症状[20]。藁本具有抗炎、解热、镇痛、中枢抑制、抗血栓等药理作用,可明显延长小鼠常压状态下耐缺氧时间，起到扩张血管、改善脑部微循环、抗心肌缺血、缺氧的作用[21]。一粒金给药方式为鼻窍给药。《丹溪心法》中记载“搐嚏流涎”，为排浊之法，可使浊阴流出，清阳之气通行，快速治疗疼痛[22]。

本研究首先借助网络药理学对一粒金治疗偏头痛的药效和机制进行预测，结果发现一粒金可通过多靶点、多通路对偏头痛发挥治疗作用，涉及的关键靶点包括TRPV1、AKT1、VEGFA等，相关通路有TNF信号通路、MAPK信号通路等。结果表明其机制可能与血管反应和炎症过程相关。结合文献调研，本研究后续实验针对TRPV1及其相关因子展开研究。

一粒金可通过调节血清ET-1、NO、iNOS及5-HT水平来抑制脑血管异常扩张，进而抑制神经源性炎症来减轻偏头疼症状。TRPV1、mGluR5为关键因子之一，与临床偏头痛生物标志物NO、CGRP均相关。一粒金可能通过调节炎症、减轻凋亡等途径发挥作用。TRPV1可被NO等内源性或外源性刺激激活，引起Ca2+内流。TRPV1上调会增加机械性痛觉和热痛觉亢进[22]，进而导致三叉神经感觉纤维末梢释放CGRP等神经递质[23]，引起神经源性炎症，继而产生偏头痛。mGluR5和TRPV1已被证明在中枢神经系统皮肤痛觉的转导和调节中发挥关键作用[24-25]。在mGlu5受体激活期间，TRPV1通道介导的膜电流增强[26]。本研究结果表明一粒金可以抑制偏头痛模型大鼠大脑皮层、延髓CGRP、TRPV1mRNA、mGluR5 mRNA表达水平从而治疗偏头痛。

综上所述，一粒金能降低偏头痛模型大鼠脑组织ET-1、NO、iNOS、CGRP、TRPV1等偏头痛生物标志物表达水平，升高脑组织5-HT水平，降低大脑皮层、延髓TRPV1 mRNA、mGluR5 mRNA表达水平，从而治疗偏头痛。鼻内给药起效快，可快速穿过血脑屏障，操作简便，受试对象适从性好。后续实验可进一步从血管收缩舒张功能或炎症水平方面研究一粒金对偏头痛模型动物的改善作用，利用质谱组学等技术研究一粒金的主要成分和药理作用物质基础，并基于体外实验和基因编辑技术对TRPV1等关键靶点进行进一步的验证，从而为鼻腔滴注一粒金治疗偏头痛的临床推广提供依据。