唐毅 周瑶 陈敏 易小明 丁建国 鲁昆 李煌

湿疹是由诸多内外因素导致的一种过敏性炎症性皮肤疾病, 患者多数病程较长, 易复发, 易诱发急性发作, 症状剧烈, 严重影响患者的生活。现代社会由于生活节奏加快、工作压力上升、环境污染、化妆品滥用及生活饮食习惯、方式改变等因素的影响, 湿疹发病率逐年升高, 且各年龄段均可发生［1］。临床常用激素类药物对短期病程患者治疗效果较好, 但对大部分病程较长的慢性湿疹患者来说, 长期应用会带来许多副作用及不良反应, 如耐药性和复发率普遍较高。而屏障修复类药物难以在短时间内缓解患者急性期症状,用药周期长, 价格较高。故提高湿疹的治疗效果、减轻患者症状及控制复发率是研究的热点［2］。中医认为湿疹的发病多为患者自身先天的禀赋不足, 加之后天饮食不节, 致使脾胃健运失常, 湿邪内生, 若复感外邪, 内外合邪, 多种邪气相互交错浸淫肌肤而发为本病［3,4］。临床对常见的脾虚湿蕴型湿疹患者, 多采用除湿胃苓汤加味对证化裁, 取得了不错的临床疗效, 能较大程度提高治愈率、降低复发率和不良反应发生率,可改善患者生活质量［5-9］。进一步研究除湿胃苓汤加减治疗的具体作用机制, 可对湿疹的临床用药提供依据和参考。代谢组学作为与表型最为接近的组学方法,是目前了解中药多靶点、多途径机制有效的方法。对中药复方采用代谢组学技术进行研究, 既能够从整体观角度考察中药复方的疗效, 又能从生物标志物及代谢通路层面考察中药复方的作用机制, 比传统的研究手段更具优势［10,11］。因此, 本研究选取脾虚湿蕴型湿疹患者, 予以除湿胃苓汤加减治疗, 从血清代谢组学的角度着手, 初步探讨其作用机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取湖南省直中医医院皮肤科2021年3～11 月收治的10 例慢性湿疹门诊患者进行研究, 男4 例, 女6 例。纳入标准：①符合慢性湿疹的中西医诊断标准；②中医辨证为脾虚湿蕴型；③年龄18～65 岁；④病程≥3 个月；⑤近2 周未服用任何皮质激素类药物, 治疗过程中未服用任何其他药物；⑥未合并有严重心脑血管、内分泌系统、造血、肝肾、精神疾病者；⑦非过敏体质者；⑧非妊娠期或哺乳期女性；⑨符合知情同意原则, 且签属知情同意书者。

1.2 治疗方法 患者均采用单纯中药复方除湿胃苓汤加减治疗。药物组成：厚朴、苍术、白鲜皮、地肤子各15 g, 猪苓、茯苓、防风、白术各10 g, 白芍12 g, 山栀子、甘草各6 g, 滑石20 g, 陈皮8 g, 肉桂3 g, 随症加减。1 剂/d, 2 次/d, 水煎煮, 早晚分服。治疗期间嘱患者少食辛辣刺激、油炸食物, 保证新鲜蔬菜和水果的摄入量, 保持心情舒畅、作息时间规律。以15 d 为1 个疗程,治疗2 个疗程后进行疗效评价及血清代谢组学研究。

1.3 实验方法

1.3.1 血清样本收集与制备 收集10 例患者药物干预前后空腹静脉血5 ml, 常温静置20 min, 4℃条件下以3500 r/min 的速度离心处理10 min, 提取上清液, 转移至冻存管, 并保存于-80℃冰箱中。另收集10 例无湿疹症状及病史的健康人血清作为健康对照血清组, 处理方法同患者治疗前血清组(10 例)和患者治疗后血清组(10 例), 待全部样本收集完成后进行代谢组学分析。取100 μl 血清与400 μl 甲醇/乙腈(V∶V, 1∶1)涡旋30 s, 超声10 min(4℃水浴), -20℃下孵育1 h 后,在4℃条件下以13000 r/min 的速度离心15 min, 取上清液, 用真空浓缩器4℃下蒸发至干。加入100 μl 乙腈/水(H2O)(V ∶V, 1 ∶1), 涡旋30 s, 超声10 min(4℃水浴),在4℃条件下以13000 r/min 的速度离心15 min 后, 取上清液进行LC-MS 检测。质量控制样品(QC 样品)通过等比混合所有血清样品组成, 按照同样的方法处理,在样品进样的不同时期进样以评价方法的稳定性。

1.3.2 LC-MS 数据采集与分析 分析仪器为超高效液 相 色 谱 仪( 岛 津Nexera UHPLC LC-30A)、Waters HSS T3 色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 µm)。色谱分离条件：流速0.3 ml/min, 进样盘温度：4℃, 柱温：40℃,流动相：A 为H2O、B 为乙腈(均含0.1%甲酸), 进样量3 μl, 分别于正负离子模式下测定。正离子模式检测条件：检测范围60～1000 m/z, 离子喷雾电压5500 V, 离子源温度：550℃, 雾化气(GAS1)：55 psi、辅助气(GAS2)：55 psi；负离子模式检测条件：检测范围60～1000 m/z,离子喷雾电压-4500 V, 离子源温度：550℃, GAS1：55 psi、GAS2：55 psi。

1.4 观察指标及判定标准 ①比较患者治疗前后的EASI 评分, 包括患处红斑、水肿、鳞屑、苔藓样变、瘙痒程度等严重程度评价。②将三组应用LC-MS 进行血清样品的分离和数据采集, 以PCA、PLS-DA 和OPLS-DA 法筛选出相关差异代谢物, 通过KEGG 和HMDB 等开放数据库对差异的标志物进行代谢通路分析。

1.5 统计学方法 经LC-MS 分析后获得原始数据,运用Progenesis QI v2.3 程序对原始数据进行处理, 包括基线过滤、峰识别与对齐、保留时间校正等。将正负离子数据合并, 得到的包括保留时间、离子模式和质核比等信息的数据导入SIMCA14.0 统计学软件进行PCA、PLS-DA, 分析各组间代谢轮廓的总体差异, 以OPLS-DA 模型的变量重要性投影(variable important in projection, VIP)1.7 为条件筛选组间差异代谢物。利用SPSS21.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t 检验, P＜0.05 为差异有统计学意义。通过KEGG 和HMDB 等开放数据库对显著差异代谢物进行代谢通路分析, 以RawP＜0.05 且Impact＞0 为条件进行分析评价。

2 结果

2.1 患者治疗前血清组、患者治疗后血清组EASI评分比较 患者治疗后血清组的EASI 评分(1.81±0.45)分明显低于患者治疗前血清组的(8.16±1.41)分,差异有统计学意义(t=13.567, P=0.000＜0.01)。

2.2 三组代谢差异分析 分析三组LC-MS 数据, PCA模型反映代谢组数据的原始状态, 可对样本间差异进行直观显示。PCA 分析图显示所有的QC 样品较接近且聚集在原点附近。见图1a。说明分析方法重复性和仪器系统稳定性均较好, 可用于进一步的组内差异分析。PCA 3D 图能更清晰地展示出三组样本点虽有交叉点, 但仍在空间分布上明显分开, 且患者治疗前血清组、患者治疗后血清组分布相对集中, 可以看到患者治疗前血清组血清中的代谢物与健康对照血清组相比发生了明显变化。中药干预后, 患者治疗后血清组血清代谢轮廓则较集中地向着健康对照血清组方向靠拢。见图1b。PLS-DA 得分图显示三组样本点分离程度较好, 表明三组间代谢模式存在差异, 且三组样本代谢变化情况具有同PCA 类似的趋势。见图2。为探究药物作用的可能机制, 进一步体现组间代谢差异, 结合OPLS-DA 分析法, 根据三组样本点两两对比的得分图,可见模型中两组别均显著地位于两侧, 说明健康对照血清组和患者治疗前血清组、患者治疗前血清组与患者治疗后血清组代谢数据之间均存在显著差异。见图3。

图1 三组血清PCA 得分图

图2 三组血清PLS-DA 得分图

图3 三组血清OPLS-DA 得分图

2.3 差异代谢物筛选 为进一步探求组间分离的标志变量, 基于OPLS-DA 模型的VIP(VIP＞1.7)和独立样本t 检验的P(P＜0.05), 从所有鉴定的化合物中筛选出42 种差异代谢物。见图4。以患者治疗前血清组出现显著异常的代谢标志物作为潜在药物靶点, 观察药物干预后的代谢物变化情况。结果显示, 患者治疗前血清组与健康对照血清组比较, 苹果酸(malic acid)、油酰基肉碱(oleylcarnitine)显著上升, L-蛋氨酸(L-methionine)、丙酰基肉碱(propionylcarnitine)、脱氧胆 酸(deoxycholic acid)、焦 谷 氨 酸(pyroglutamic acid)、甲基半胱氨酸(methylcysteine)、 谷氨酸肉碱(glutarylcarnitine)、L-苏氨酸(L-threonine)、L-异苏氨酸(L-allothreonine)、L-亮氨酸(L-leucine)、L-缬氨酸(L-valine)显著下降；经过除湿胃苓汤加减治疗后, 以上12 种代谢物水平均出现显著回调, 接近健康对照血清组正常值, 提示这12 个代谢物及其相关通路变化是除湿胃苓汤加减治疗脾虚湿蕴型慢性湿疹的可能机制。

图4 组间差异代谢物筛选

2.4 代谢通路分析 为进一步解释药物作用的可能代谢机制, 通过KEGG 和HMDB 等开放数据库对差异的标志物进行通路分析和富集分析。以RawP＜0.05 且Impact＞0 为条件进行通路分析可得, 影响最大最显著的是D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢途径(D-Glutamine and D-glutamate metabolism)(Impact=0.5, P=0.002＜0.05)。见图5。以P＜0.05 为条件, 富集分析结果可见, 富集程度最高的是D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢途径及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径(Valine, leucine and isoleucine biosynthesis)。见图6。

图5 差异标志物代谢通路气泡分析

图6 差异标志物代谢通路富集分析

3 讨论

本研究属于丁建国全国名老中医传承工作室建设项目。丁建国教授指出, 脾虚湿蕴证多由脾胃运化功能失常及湿邪困阻脾胃所致, 脾失健运使得水谷精微物质的吸收和消化功能失常, 皮肤、胃肠道功能出现损伤, 继而引起机体代谢功能紊乱。除湿胃苓汤加减治疗脾虚湿蕴型湿疹已获得了明确的临床疗效, 本文现从血清代谢组学的角度研究其起效机制。代谢物是生物体表型的基础, 以此为切入点进行研究, 能更直观、有效地了解机体体内受内外界诸多因素干扰后发生的改变及其机制, 从而研究机体整体生物学状况和功能调节。研究结果可见, 以患者治疗前血清组出现显著异常的代谢物作为潜在药物靶点, 筛选出的治疗后较治疗前显著回调的12种代谢物中有7种是氨基酸、肽和类似物, 提示除湿胃苓汤加减治疗脾虚湿蕴型湿疹可能与调节氨基酸及其衍生物代谢相关。

进一步的代谢通路分析得到影响最显著和富集度最高的D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢途径及富集度较高的缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径。谷氨酰胺是谷氨酸的酰胺, 是最基础的蛋白质原料, 可由葡萄糖转变而来, 通常作为补充身体储存氨基酸的一种手段［12,13］。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸都是人体的必需氨基酸, 均为支链氨基酸, 它们共同促进身体正常生长, 促进骨骼、皮肤及受损肌肉组织的愈合, 调节血糖,并提供需要的能量［14-16］。这些主要代谢通路上的富集氨基酸在治疗后均呈明显上调趋势。糖是人体的重要供能物质, 血糖水平能在一定程度上反映出机体能量代谢方面变化［17］。研究表明, 湿阻中焦证会影响机体葡萄糖代谢并导致葡萄糖代谢失衡［18］, 苍附导痰汤加减方能通过调节患者的糖代谢紊乱治疗痰湿型多囊卵巢综合征合并胰岛素抵抗［19］。综合文献报道和研究结果推测, 脾虚湿蕴型慢性湿疹患者体内存在能量代谢紊乱, 而健脾利湿辨证治疗可以通过D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢途径和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径调节机体内能量代谢, 从而达到治疗作用。

另外, 氨基酸作为构成蛋白质的基本单位, 对免疫系统有着重要的作用。谷氨酰胺能促进肠道免疫功能, 为肠黏膜上皮细胞及淋巴细胞提供能量, 在维持肠道淋巴组织及合成分泌型免疫球蛋白(SIgA)中发挥重要作用。苏氨酸是富集于缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径中的代谢物, 是合成小肠黏液蛋白的重要成分, 具有维持机体正常生长发育及免疫调节的作用［20-22］。由于苏氨酸的结构中含有羟基, 对人体皮肤具有持水作用, 与寡糖链结合, 对保护细胞膜起重要作用。缬氨酸和异亮氨酸作为可通过转氨基作用生成琥珀酰辅酶A, 在琥珀酸硫激酶的作用下生成琥珀酸, 琥珀酸是先天免疫信号的代谢物［23］。

综上所述, 除湿胃苓汤加减可能通过调控氨基酸及其衍生代谢等途径调节机体能量代谢和免疫功能来治疗脾虚湿蕴型慢性湿疹。除湿胃苓汤加减治疗脾虚湿蕴型慢性湿疹的作用机制可能与调节机体能量代谢和免疫功能有关, 对进一步靶向代谢组学及慢性湿疹不同证型研究提供一定的参考意义。