翟文静,仇永乐,刘珊珊,刘铁军,吕飞飞

(1.河北省石家庄市人民医院口腔科,河北 石家庄050000;2.河北医科大学第四医院口腔科,河北 石家庄 050017;3.河北大学附属医院口腔科,河北 保定 071000)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常见的头颈部肿瘤之一,占口腔恶性肿瘤总数的90%[1]。OSCC患者的5年生存率为60%～80%,未确诊患者的生存率低于50%[2]。辅助治疗在治疗晚期癌症方面发挥重要作用[3],而这种预治疗仅对部分患者有效[4]。目前为止,还没有可靠的生物标志物来评估患者对该疗法或肿瘤生物学特征的反应。微核糖核酸(microRNA,miRNA)是小片段非编码单链内源RNA分子,能够识别并参与调控化疗耐药性。引起化疗耐药的原因涉及多个方面,如药物的跨膜运输[5],细胞内药物代谢[6]或细胞增殖和凋亡[7]。miRNA可调节转录后全基因组表达[8],并参与操控诸多细胞活动,包括细胞分化、增殖、凋亡和新陈代谢[9]。此外,miRNA与癌症[10]对化疗的敏感性[11]已被广泛研究,而未见关于耐药口腔鳞癌的系统性分析。本研究旨在系统的检测耐药细胞系中特征性miRNA与耐药化疗表型的相关性。此外,课题组还进一步验证这些特征性miRNA是否影响口腔鳞癌细胞系的生物学行为。最后,研究这些特征性miRNA对细胞内通路的调节作用,探讨这种调控作用与化疗耐药性的相关性。

1 材料与方法

1.1细胞培养 OSCC细胞系SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R(DSMZ,德国)采用标准培养基和操作流程进行培养[12]。在3个细胞系中研究miRNA对OSCC细胞系化疗耐药性的影响。在2个细胞系(SCC084/R,SCC9/R)中研究miRNA对OSCC细胞系凋亡和细胞周期的影响。在SCC084/R、SCC9/R细胞中进行靶点分析。

1.2miRNA的筛选与表达调控 从耐药OSCC细胞特征性miRNA中筛选出研究较为深入的miR-125a-5p、miR-130a-3p和miR-27b-5p进行研究。在顺铂耐药的OSCC细胞中,miR-27b-5p能显著提高其药物敏感性[13]。此外,miR-130a-3p能影响口腔鳞癌耐药细胞系对顺铂和5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)的敏感性[14]。miRNA通过脂质体LipofectamineTM2000(Life Technologies,Carlsbad,美国)瞬时转染[15]。本研究通过转染miR-125a-5p模拟物(miR-125a-5p M),miR-27b-5p模拟物(miR-27b-5p M),miR-130a-3p抑制剂(miR-130a-3p I),上调靶细胞中miR-125a-5p和miR-27b-5p的表达,降低miR-130a-3p的表达,以空质粒转染组(Sham)为作为对照。miRNA的模拟物/抑制剂购自Qiagen(德国)。联合转染用于研究miRNA共转染对耐药细胞系的生物学影响。通过qRT-PCR(Beckman Coulter,美国)评估转染水平[15],SNORD25、SNORD68和RNU6B(Qiagen,德国)作为管家基因。

1.3化疗处理和活力测定 转染后24 h用顺铂和5-FU进行化疗。72 h使用MTT检测(Sigma Aldrich,美国)[15]进行活力测定,细胞生存率越低,说明药物越敏感,所有实验组一式四份。

1.4凋亡和细胞周期分析 miRNA对细胞凋亡的影响和细胞周期在转染后48 h进行检测[凋亡:FITC Annexin V/7-AAD 凋亡试剂盒(BioLegend,英国)];根据说明书使用Beckman Coulter FC500(Beckman Coulter,美国)流式细胞仪测试,细胞数=20 000,使用CXP-软件(Beckman Coulter,美国)进行数据采集,早期凋亡(Annexin V阳性和7AAD阴性)和晚凋亡细胞(Annexin V和7AAD阳性):所有实验组一式四份。

1.5靶点分析 选择来自miRNA靶基因预测数据库TargetScan的不同miRNA的潜在目标基因,Total Context score≤0.5:Bcl-2,BIM,X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)、丝裂原和应激激活蛋白激酶1(mitogen-and stress-activated protein kinase 1,MSK-1)、多药耐药蛋白1(multidrug resistance protein 1,MDR1)、DNA(胞嘧啶-5)甲基转移酶[DNA (Cytosine-5)-methyltransferase 1,DNMT1]、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARy)、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,ErbB2/Her2)、p53和组蛋白脱乙酰酶4(histone deacetylase 4,HDAC4)。进一步分析凋亡通路的下游靶点caspase 3(Casp3),caspase 9(Casp9),Tubulin-β-3为对照组。

一抗购自Invitrogen(美国),二抗使用抗兔 HRP 和抗鼠HRP(A6154,A9044:Sigma-Aldrich)。细胞在转染48 h后收集,将15～30 μg蛋白加入到6%～10%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)变性聚丙烯酰胺凝胶上。随后将蛋白质转移置PVDF膜上,封闭。一抗4 ℃下孵育过夜,清洗,二抗孵育。用ECL-plus-Western blotting检测系统检测条带生成(Immobilon,Millipore,美国)。

1.6统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析数据。计量资料比较采用单因素方差分析和t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1耐药OSCC特征性miRNA对化疗耐药性的影响 顺铂化疗组中,miR-27b-5p上调组SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R细胞生存率低于Sham组,miR-130a-3p下调组SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R细胞生存率低于Sham组,miR-125a-5p上调组SCC9/R细胞生存率低于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。说明,miR-27b-5p上调提高了SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R细胞对顺铂的敏感性。miR-130a-3p下调提高了SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R细胞对顺铂的敏感性,miR-125a-5p上调提高了SCC9/R细胞对顺铂的敏感性。FU化疗组中,miR-27b-5p上调组SCC9/R细胞生存率低于Sham组,miR-130a-3p下调组SCC084/R细胞生存率低于Sham组,miR-125a-5p上调组SCC131/R和SCC09/R细胞生存率高于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。说明,miR-27b-5p上调组提高了SCC9/R细胞对5-FU的敏感性;miR-130a-3p下调提高了SCC084/R细胞对5-FU的敏感性,miR-125a-5p上调降低了SCC131/R和SCC09/R细胞对5-FU的敏感性。见表1。

表1 单独转染miRNA对化疗后细胞毒性的调控作用

2.2共转染对顺铂耐药性的增效/拮抗效应 评估miR-27b-5p、miR-130a-3p和miR-125a-5p对化疗药物增敏作用的潜在增效/拮抗作用。通过上调miR-27b-5p表达,同时上调miR-125a-5p或下调miR-130a-3p表达,检测miRNA共转染对顺铂和5-FU化疗敏感性的影响。

在顺铂用药组中,miR-130a-3p 下调/miR-27b-5p上调组中SCC084/R和SCC131/R细胞的生存率低于miR-130a-3p下调和miR-27b-5p上调组,差异有统计学意义(P<0.05)。说明在SCC084/R和SCC131/R细胞中,共转染的增效作用高于单个miRNA转染组。miR-125a-5p上调/miR-27b-5p上调组的SCC084/R和SCC131/R细胞生存率低于单个miRNA转染组,差异有统计学意义(P<0.05)。说明miR-125a-5p上调/miR-27b-5p上调共转染组在SCC084/R和SCC131/R细胞中增效作用高于单个miRNA转染组,见表2。

表2 共转染miRNA对化疗后细胞毒性的调控作用

在5-FU用药组中,与单个转染组相比,miR-130a-3p下调/miR-27b-5p上调组未显示出明显的增效作用(P>0.05)。与单个转染组相比,miR-125a-5p上调/miR-27b-5p上调组在SCC084/R和SCC9/R细胞中显示出显著增效作用(P<0.05),见表2。

2.3miRNA对耐药OSCC凋亡和细胞周期影响 所选miRNA的表达水平改变显著提高细胞凋亡水平,特别是晚期凋亡率。在SCC084/R细胞中,miR-27b-5p上调组、miR-125a-5p上调组早期凋亡率高于Sham组,miR-130a-3p下调组、miR-27b-5p上调组、miR-125a-5p上调组晚期凋亡率高于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。在SCC131/R细胞中,miR-130a-3p下调组、miR-27b-5p上调组、miR-125a-5p上调组早期凋亡率和晚期凋亡率高于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 miRNA转染对耐药OSCC细胞凋亡诱导作用

在SCC084/R细胞中,miR-125a-5p上调组、miR-130a-3p下调组G1期比例低于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。在SCC131/R细胞中,miR-125a-5p上调组G1期比例低于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 miRNA转染对耐药OSCC细胞周期的影响

2.4miRNA表型对OSCC耐药通路的作用 为检测所选miRNA对下游信号通路的影响,分析了一些潜在靶点。Western blotting分析表明,在SCC131/R中,相对于Sham组,miR-125a-5p上调组会降低DNMT1,MSK-1,Bcl-2和Bim的蛋白水平表达,差异有统计学意义(P<0.05)。相对于Sham组,miR-130a-3p下调组MDR-1和Bcl-2蛋白水平下调,XIAP蛋白水平上调(P<0.05)。相对于Sham组,增加miR-27b-5p的表达水平导致ErbB2和HDAC4的蛋白水平下降,差异有统计学意义(P<0.05),见图1,表5。由于上述通路大部分能靶向调控终端凋亡信号,随后进一步分析下游凋亡通路,Caspase 3和Caspase9的表达水平。研究发现,相对于Sham组,miR-130a-3p下调组,miR-27b-5p上调组,miR-125a-5p上调组,均能上调SCC131/R和SCC084/R细胞中Caspase 3和Caspase9蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05),见图2,表6。

图1 miRNA转染对耐药OSCC细胞内蛋白表达的影响

图2 miRNA转染对耐药OSCC细胞内凋亡蛋白表达的影响

表5 miRNA转染对耐药OSCC细胞内蛋白表达的调控作用

表6 miRNA转染对耐药OSCC细胞内凋亡蛋白表达的调控作用

在SCC084/R细胞中相对于Sham组,miR-125a-5p上调组会降低DNMT1,Bcl-2及Bim的蛋白水平表达,差异有统计学意义(P<0.05)。相对于Sham组,miR-130a-3p下调组MDR-1和Bcl-2蛋白水平下调,XIAP蛋白水平上调(P<0.05)。相对于Sham组,增加miR-27b-5p的表达水平导致ErbB2和HDAC4的蛋白表达下调,同时p53的蛋白水平上调,差异有统计学意义(P<0.05),见图1,表5。由于上述通路大部分能靶向调控终端凋亡信号,随后进一步分析下游凋亡通路,Caspase 3和Caspase9的表达水平。研究发现,相对于Sham组,miR-130a-3p下调组,miR-27b-5p上调组,miR-125a-5p上调组,均能上调SCC131/R和SCC084/R细胞中Caspase 3和Caspase9蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05),见图2,表6。

3 讨 论

化疗耐药严重影响OSCC患者的预后。识别或预后不良反应监测对于患者能否得到个性化治疗及其重要。Rajan等[16]对耐药OSCC中特征性miRNA表达识别的研究表明,miRNA在OSCC的化疗耐药性和肿瘤生物学的表观遗传调节中可能起关键作用。

本研究的数据证明耐药OSCC中特征性miRNA是导致该肿瘤的抗化疗表型的原因之一。通过分析3个耐药OSCC细胞系中的3个miRNA证实,在三个细胞系中miR-125a-5p、miR-27b-5p和miR-130a-3p能显著影响癌细胞对顺铂的敏感性。而仅在SCC084/R的测试细胞系中,对5-FU的敏感性显著提高。此外,三个miRNA的转染都能影响细胞凋亡,可导致部分细胞G1期阻滞。Western blotting结果表明,这些miRNA在不同的耐药性相关通路中调控多个靶点,包括凋亡的p53通路、DNA甲基化或组蛋白修饰。由于Bcl-2和p53都是凋亡依赖性通路的一部分,数据表明,miRNA不仅针对几个不同的耐药性相关通路,还针对单个通路中的不同关键蛋白质。关于在凋亡信号中下游靶点Caspase 3和Caspase9的表达进一步验证了上述观点。

本研究的miRNA与许多其他癌症的化疗耐药性有关,但部分结果相互矛盾:miR-125可提高宫颈癌对紫杉醇与顺铂的敏感性[17]但会增加胰腺癌对Gemcitabine 的耐药性[18]。miR-130a的高表达与肝癌[19]对Gemcitabine的敏感性增加有关,而其他报道显示miR-130a增加了卵巢癌中铂基化疗的耐药性[20]。miR-27b的下调能增加胃癌的多药耐药性[21],同时miR-27b的上调能提高顺铂耐药口腔鳞癌的化疗敏感性[22]。

本研究中,miRNA对顺铂或5-FU治疗的不同影响可能是由这两种药物的具体作用机制引起的,5-FU是一种经典的抗代谢药物。这些药物可抑制必要的生物合成过程,与DNA和(或)RNA结合,并损害其正常功能。顺铂通过与细胞核和细胞质信号通路中的复杂相互作用发挥其抗癌功能。本研究中选择的miR-125a-5p、miR-27b-5p、miR-130a-3p能作用于Bcl-2 和 p53通路,它们的主要作用与对顺铂相关,与5-FU的相关性不明显。

最后,同时操纵两个miRNA的表达水平,在50%(miR-125a-5p/miR-130a-3p)和83%(miR-130a-3p/miR-27b-5p)的测试细胞系中表现出对治疗的增敏效果。与miRNA共同转染的实验数据较为有限[23]。Zheng等[24]研究表明,与miR-125b和miR-141模拟物,增加了乳腺癌细胞系对Taxane-Anthracycline的耐药性。Wang等[25]研究表明,联合抑制以下两个miRNA(miR-125a,miR-125b,miR-205)降低了Entinostat对乳腺癌细胞的凋亡作用。这些数据初步揭示了miRNA对化疗耐药的协同调控作用。

由于体外细胞不能完全反映遗传背景下人肿瘤的异质性,该模型的临床参考价值有限。本研究通过使用三种不同的耐药OSCC细胞系来“模仿”临床样本中的人肿瘤细胞的变异性来解决上述问题。此前诸多项研究表明miRNA能影响大多数细胞系的化疗耐药性,这表明本研究观察到的结果不局限于单个OSCC耐药细胞系。