刘怡斐，王鑫宇，王嘉慧，杜晓冰，王 途，赵 娟

承德医学院 基础医学院，河北 承德 067000

尾加压素Ⅱ(urotensin,UⅡ)与G蛋白偶联受体(GPR14)构成的UⅡ/UT具有促进动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)等心血管疾病的作用[1]。Urantide是由在UⅡ 衍生而来的受体拮抗剂,可抑制UⅡ/UT系统影响多条信号通路发挥生物学作用[1-3]。JAK2/STAT3(Janus kinase 2 and signal transducer and activator of transcriptions 3)信号通路活化在肾损伤中发挥至关重要的作用,抑制其活性可有效恢复肾脏功能[4-6]。本课题组前期研究[7-8]发现,urantide可竞争性拮抗UⅡ,有效改善AS大鼠的病理变化,机制尚不清楚。JAK2/STAT3信号通路在AS相关肾损伤中是否具有作用?本研究探索了urantide在AS大鼠发生发展过程中对肾脏JAK2/STAT3信号通路的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及实验主要试剂

Wistar雄性大鼠,(190±10)g,SPF级(北京维通利华)。Urantide(苏州强耀生物公司);辛伐他汀(simvastodin,北京诺华制药公司)。免疫组织化学染色试剂盒(北京中杉金桥生物公司);p-JAK2和p-STAT3(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理:将大鼠分为:1)正常组(n=10);2)模型组(n=40),饲以高脂特制饲料,连续3 d每天腹腔注射给予 VitD3150 U/(kg·d-1)。实验周期为6周。辛伐他汀组 (n=10)每天灌胃给予5 μg/kg,连续14 d;干预模型组(7 d和14 d)(每组n=10)每天尾静脉注射 30 μg/(kg·d-1),分别连续7 d和14 d。

1.2.2 HE和Masson染色检测病理:取大鼠组织蜡片进行染色,在光镜下观察胸主动脉和肾脏的组织形态变化,随机选择10个视野评估肾小球的硬化[9]和肾小管间质损伤程度[10]。

1.2.3 免疫组织化学染色法检测蛋白:严格按照试剂盒说明进行操作,应用病理图形分析软件Image J-Pro Plus 6.0 计算各组肾脏组织中p-JAK2和p-STAT3阳性表达的平均吸光度(A)值。

1.2.4 RT-qPCR检测肾组织JAK2/STAT3 mRNA:Trizol法提取肾脏组织总RNA,按照试剂盒操作说明,检测JAK2、STAT3和β-actin mRNA的Ct值,并以目的基因与β-actin mRNA Ct值的差值为ΔCt,运用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 胸主动脉形态变化

模型组大鼠胸主动脉内膜下出现结缔组织钙化、泡沫细胞形成,弹性纤维变性、断裂等典型AS病理形态改变(图1)。

图1 胸主动脉的形态变化

2.2 肾脏形态变化

模型组肾组织水肿,肾小球萎缩且与周围组织黏连,肾小管上皮细胞萎缩变性甚至有坏死征象,胶原纤维大量表达于肾小球与小管间质中为典型的肾损伤特征;肾小球和肾小管间质损伤评分均升高(P<0.01)。与模型组相比,经urantide治疗后肾脏病理变化得到有效改善(P<0.01)(图2)。

2.3 Urantide对肾组织JAK2/STAT3表达的影响

模型组大鼠肾组织的肾小球和肾小管间质中p-JAK2和p-STAT3阳性颗粒表达明显强于正常组。与模型组相比,urantide组p-JAK2和p-STAT3在肾小球和肾小管间质中阳性颗粒表达下降(P<0.05,P<0.01)(图3)。

*P<0.01 compared with normal group; #P<0.05,##P<0.01 compared with AS model group; △P<0.05 compared with simvastatin group.

2.4 Urantide对肾组织JAK2/STAT3基因表达的影响

模型组肾组织中JAK2和STAT3的基因表达水平较正常组升高。干预模型组JAK2和STAT3 mRNA在肾组织中表达较模型组下降(P<0.05,P<0.01)(图4)。

*P<0.01 compared with normal group; #P<0.05,##P<0.01 compared with AS model group; △P<0.05,△△P<0.01 compared with simvastatin group.

3 讨论

AS严重威胁人类健康,在其进展过程可促进肾动脉狭窄造成缺血性损伤而影响滤过与重吸收功能[11]。研究发现,AS大鼠肾小球肾小管间质结构明显受损,说明在发生AS时肾脏功能发生异常。

JAK2/STAT3信号通路在肾损伤中大量激活,严重影响肾脏的代谢能力以形成恶性循环进而加重肾脏损伤[4-6]。本课题组发现,p-JAK2和p-STAT3阳性颗粒及基因表达水平升高,其可能对肾脏的滤过与重吸收功能有一定影响。为进一步探究JAK2/STAT3通路对AS大鼠肾脏的作用机制,本研究采用辛伐他汀和urantide治疗AS大鼠以观察两种药物对AS大鼠的肾损伤的修复作用。

Urantide作为UⅡ受体拮抗剂,对心肌缺血/再灌注损伤具有防治作用,同时对平滑肌细胞增殖及胶原合成亦具有抑制作用[2,8]。本次研究显示,AS大鼠经urantide治疗后,肾脏组织水肿现象减轻,肾小球萎缩与黏连程度得到改善,肾脏功能得到有效改善。相应地,urantide降低了JAK/STAT3信号通路活化状态。由此说明,urantide可通过抑制该通路以改善肾脏功能。然而,p-JAK2和p-STAT3在肾小球和肾小管间质中分布存在差异,说明两者可能分别影响肾脏的重吸收、滤过功能,但其作用机制仍需深层次研究。

综上所述,VitD3给药及高脂饮食在诱导AS发生的同时引发了肾损伤。本研究进一步证明,urantide可缓解AS大鼠肾损伤,可能与抑制JAK2/STAT3信号通路的激活有关。