赵 芳，赵 青，刘玮琳，李 菲

河北省第八人民医院 河北省老年病医院 1.呼吸肾内科；2.医教处，河北 石家庄 050000；3.河北医科大学第四医院 感染性疾病科，河北 石家庄 050000；4.河北医科大学第一医院 保健处，河北 石家庄 050000

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)以气道阻塞和肺实质破坏为特征的进行性炎性疾病。据报道,香烟烟雾(cigarette smoke,CS)暴露导致气道内炎性细胞积聚,产生大量促炎细胞因子,以及COPD小鼠模型中的上皮和血管重塑[1-2]。因此,阐明COPD的发病机制具有重要意义。没食子酸(gallic acid,GA)是已被证实具有强大的抗氧化、抗癌、抗感染、抗血管生成和抗菌特性[3-4]。最近的研究表明,GA在肺疾病中的保护作用,如卵清蛋白诱导的过敏性气道炎性反应、膀胱素诱导的肺纤维化和百草枯介导的肺损伤,可能通过发挥其抗氧化作用[5]。然而,GA在COPD发病中作用及其分子机制中尚未完全明晰。因此,本研究旨在使用CS诱导的COPD模型小鼠评估GA对COPD气道炎性反应和气道重塑的作用及分子调控机制。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 动物:30只SPF级C57BL/6小鼠(6周龄,180～220 g,成都达硕实验动物有限公司)。所有实验小鼠可以自由获得食物和水。本研究获得河北省老年病医院动物护理与使用委员会批准(20220013)。

1.1.2 试剂和抗体:没食子酸(gllic acid,GA)(Thermo Fisher Scientific公司)。小鼠IL-6、TNF-α和L-1β ELISA测定试剂盒(Millipor公司)。蛋白质羰基检测试剂盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、谷胱甘肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl+glycine,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)(上海臻科生物科技有限公司)。Anti-IL-13、anti-STAT6、anti-β-actin和anti-IgG(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组及处理:将动物置于与泵相连的吸入室内,并暴露于CS 3 d。通过燃烧3R4F香烟产生烟雾,每支雪茄含有9.4 mg焦油和0.726 mg尼古丁。小鼠连续3 d暴露于CS(每天5次,30 min无烟间隔,每次30 min)。

分组:CS组(n=6);CS+GA组(每只小鼠200 mg/kg;n=6);CS+shikonin组(IL/STAT6通路抑制剂每只小鼠200 mg/kg;n=6);CS+PBS组(每只小鼠200 mg/kg;n=6),每只小鼠给药1次,然后连续3 d暴露于CS。对照组(control)暴露于正常空气中。最后1次CS治疗后24 h,处死小鼠,取肺组织进行苏木精和伊红(HE)染色。

1.2.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集和分析:麻醉后,切开小鼠颈部皮肤,分离皮下组织暴露气管。随后,结扎小鼠的左支气管,在右支气管放置静脉穿刺套管针,并使用冰冷PBS(0.5 mL)滴入右肺,然后停药。液体体积≥80%视为合格,重复该操作3次。接下来,收集BALF并离心以沉淀细胞。收集上清液并在80 ℃下储存,而将细胞沉淀重新悬浮在PBS中(1 mL);用血细胞仪计数炎性细胞,在Wright和Giemsa染色后计数嗜酸性粒细胞。

1.2.3 ELISA检测肺组织炎性因子:将肺组织磨碎并匀浆,用ELISA测定试剂盒分析IL-6、TNF-α和L-1β的含量。

1.2.4 分析蛋白质羰基活性、ROS活性、GSH含量和MDA水平:使用在预冷的 PBS中制备的肺组织匀浆评估各种生化参数。活性氧(ROS)检测试剂盒、谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒和丙二醛检测试剂盒(MDA)分别检测肺组织匀浆中蛋白质羰基活性、ROS活性、谷胱甘肽(GSH)和MDA含量。

1.2.5 Western blot检测IL-13、STAT6的表达:在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中通过台盼蓝从冷冻肺组织中提取蛋白质。将尿肺组织裂解物在4 ℃ 10 000 r/min离心10 min;随后,除去上清液并用作总蛋白提取物。接着,用核蛋白提取试剂盒提取了核蛋白提取物。BCA蛋白质测定法用于测量蛋白质浓度。利用10% SDS-PAGE电泳对蛋白质样品进行分离,并将蛋白质转移到PVDF膜上。PVDF膜在室温下在5%BSA中孵育2 h,并在TBST中通过5 min洗涤洗涤洗涤3次,然后与anti-IL-13(1∶1 000)、anti-STAT6(1∶1 000)、anti-β-actin(1∶20 000)在4 ℃下孵育过夜。随后,将膜在TBST中洗涤3次,然后用山羊抗兔辣根过氧化物酶偶联抗体(1∶2 000)孵育2 h,并通过化学发光检测试剂盒进行观察。

1.2.6 HE染色检测肺组织病理变化:将肺组织固定在甲醛中,然后包埋在石蜡块中。切片固定在显微镜下的载玻片上,用苏木精和伊红(HE)染色。染色的载玻片在显微镜下进行分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 GA对CS组小鼠肺部炎性和小气道重塑的抑制作用

与对照组相比,CS组小鼠表现出炎性细胞向肺部的浸润增加,而GA处理减弱了肺泡间隙中大多数炎性细胞的浸润(图1A)。与此同时,与对照组相比,CS组小鼠肺部炎性评分升高、气道上皮厚度和支气管周围胶原沉积升高(P<0.05)(图1B),而GA处理可以减轻。此外,与对照组相比,CS组小鼠BALF中观察到中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的数量显著增加,而GA组显著减弱了中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的累积(P<0.05)(图1C)。免疫组化检测结果显示,与对照组相比,CS组小鼠肺部组织中CD68和CD11b的表达显著升高,而GA处理可以减轻这一结果(P<0.05)(图1D)。最后,与对照组相比,CS组小鼠肺组织匀浆中IL-6、TNF-α和IL-1β的显著增加,而GA组显著降低(P<0.05)(图1E)。

2.2 GA对CS组小鼠肺组织氧化还原失衡的影响

与对照组相比,CS组小鼠肺组织中ROS的产生明显增加,但肺中GSH含量显著减少。与CS组小鼠相比,GA处理使肺的组织中ROS和GSH含量的正常化(P<0.05)(图2A,B)。结果显示,与CS组小鼠相比,GA治疗的CS小鼠组织中的MDA显著降低(P<0.05)(图2C),蛋白质羰基含量显著提高(P<0.05)(图2D)。

CS.cigarette smoke; GA.gllic acid; A.test the ROS content; B.to detect the content of GSH; C.to detect the content of MDA; D.detection of protein carbonyl group; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with CS+PBS group.

2.3 GA通过抑制IL-13/STAT6信号通路减轻CS诱导的肺部炎性

与对照组相比,CS组的小鼠肺组织中IL-13和STAT6的表达显著提高,而GA处理可以显著减少这一影响(P<0.05)(图3A)。与对照组小鼠相比,CS组小鼠表现出炎性细胞向肺部的浸润增加,而shikonin处理减弱了暴露于CS的肺泡间隙中大多数炎性细胞的浸润(图3B)。与此同时,CS组小鼠肺部炎性评分升高、气道上皮厚度和支气管周围胶原沉积升高(P<0.05)(图3C),而shikonin处理可以缓解这一结果。此外,shikonin处理显著减弱了CS诱导的累积中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞(P<0.05)(图3D)。最后,对BALF中炎性因子的分析结果显示,shikonin处理显著减轻了CS暴露导致小鼠肺组织匀浆中IL-6、TNF-α和IL-1β的显著增加(P<0.05)(图3E)。

CS.cigarette smoke; GA.gllic acid; A.expression of IL-13 and STAT6 was detected; B.inflammation score,epithelial thickness and peribronchial collagen deposition analysis; C.HE staining of lung tissue; D.number of inflammatory cells was measured; E.detectction of the level of inflammatory factors; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with CS+PBS group.

3 讨论

天然产物因其药用特性而被广泛认可,并且已经成为最成功的潜在药物来源。多项体外及体内研究报道天然产物通过改善氧化应激和炎性反应对抗慢性阻塞性肺疾病表现的直接作用[6-7]。GA是一种广泛存在于水果,蔬菜和饮料等中的植物多酚,具有强效的抗氧化特性,并且在临床前研究中显示出对不同慢性疾病的有益作用[8-9]。有趣的是,在健康成年人和经过体质量训练的男性身上进行的临床试验表明,经常饮用绿茶(富含GA)会导致氧化应激明显减少,并增强这些个体的抗氧化能力[10-12]。本研究数据显示 GA 减少了 CS诱导的小鼠模型肺组织中的中性粒细胞和巨噬细胞浸润,减少了炎性因子的表达,提示酚类化合物的保护作用。

氧化应激在COPD的发病机制中起着至关重要的作用。CS和炎性细胞是肺部氧化应激的主要来源,导致脂质、蛋白质、核酸氧化和组织损伤。来自慢性阻塞性肺疾病患者的血浆和血清样本显示,MDA和蛋白羰基等氧化应激标志物水平升高,而这些患者的抗氧化能力明显下降[13]。除了减少中性粒细胞浸润外,GA给药还使氧化还原失衡恢复到正常,这反映在各种氧化应激标志物 (ROS、GSH、MDA、蛋白羰基)上,这表明其具有强大的抗氧化潜力[14]。这些研究证明了GA的抗氧化潜力,但目前尚不清楚这种植物化学物质是如何在癌中发挥其促氧化作用的。

此外,IL-13/STAT6信号通路参与调控氧化应激,并且与肺部疾病的炎性反应密切相关。据报道,STAT6的激活可以通过抵抗氧化应激来防止颗粒诱导的肺部炎性损伤[15]。一项研究表明IL-4R通过抑制IL-4/STAT6途径抑制支气管哮喘中的气道炎性。与以前的报道一致,本研究的数据显示 GA可以抑制IL-13/STAT6信号通路活化与促炎细胞因子如 IL-6、TNF-α 和 IL-1β的产生减少有关。总之,在目前的研究中,GA 显著抑制氧化应激和 IL-13/STAT6信号通路活性以及抑制炎性反应,表明 GA 可能通过调节氧化应激-IL-13/STAT6轴来抑制炎性反应。

总之,GA对COPD症状具有改善作用。本研究证明GA通过纠正氧化还原失衡和抑制IL-13/STAT6信号通路的活性,从而抑制COPD相关的促炎因子的表达,来减弱CS诱导的小鼠气道炎性反应。