甲状腺癌是常见的内分泌肿瘤,其中甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer,PTC)是最常见的甲状腺癌类型[1]。随着甲状腺健康体检的普及和检查技术的提高,PTC的检出率越来越高,多数患者预后良好,但仍有10%患者会发生肿瘤复发或远处转移[2],亟需寻找与甲状腺癌侵袭和转移相关的生物标志物以改善此部分患者的生存和预后。

肌动蛋白结合蛋白(transgelin2,TAGLN2)与人脑胶质瘤、乳腺癌及结直肠癌的侵袭与转移密切相关[3],但在甲状腺癌中的作用及其调控机制尚不清楚。微小RNA(microRNA,miRNA)在基因的转录后微调控中起着关键作用。miR-206通过靶向下游分子,抑制结肝内胆管细胞癌[4]和非小细胞肺癌[5]的增殖、迁移和侵袭,其在PTC中侵袭转移的作用机制研究尚未见报道。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)HOTAIR通过miR-206调节斯钙素(stanniocalcin,STC)进而影响肿瘤细胞生物学功能[6],有学者报道HOTAIR在PTC中高表达,对PTC的发展有重要的调节作用[7]。本研究旨在探讨HOTAIR、miRNA-206和TAGLN2是否通过相互作用参与调节PTC的侵袭转移,为PTC侵袭、转移和治疗提供新的研究依据和靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要细胞和组织样本:人甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1(北京北纳创联生物技术研究院);10例甲状腺乳头状癌和对应癌旁组织取自就诊于兰州大学第一医院的甲状腺癌患者,所取标本均由病理确诊为甲状腺癌。项目通过兰州大学第一医院伦理委员会的批准(LDYYLL2021-20),并取得所有参与者的知情同意。

1.1.2 试剂及试剂盒:DMEM培养基、胰蛋白酶和血清(Gibco公司);Lipofectamine 3000转染试剂(Sigma-Aldrich公司);GAPDH、HOTAIR、miR-206、TAGLN2引物、反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司);miR-206 Mimic和silncRNAHOTAIR(广州锐博生物技术有限公司);抗GAPDH和TAGLN2抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养:用含10% FBS+1%双抗的 DMEM 培养基在5% CO2,37 ℃恒温培养箱中培养甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1,达到 90% 左右汇合时进行细胞转染实验及后续相关的实验。

1.2.2 细胞的转染:按照阳离子脂质体转染试剂 Lipofectamine3000、miRNA-206 mimic和silncRNA HOTAIR的说明书,将转染试剂和目标RNA制剂加入增值状态良好的对数增值期的TPC-1细胞中,加入无抗生素和无血清的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养4～6 h后,换用含15%FBS的DMEM培养基继续培养。

1.2.3 荧光实时定量PCR(RT-qPCR)检测mRNA:Trizol试剂盒抽提总RNA,检测RNA浓度,按反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。取反转录产物进行扩增反应,每个样本重复3次。用SYBR Green染料法,以GAPDH为内参照,设计目标基因引物(表1)。PCR反应条件为:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,95 ℃ 15 s,共40个循环。反应完成后,分析相应Ct值,得出各组之间基因的mRNA表达水平的差异。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.4 Western blot检测目标蛋白质:用蛋白质提取试剂盒提取细胞和组织蛋白质,BCA蛋白质定量试剂盒检测蛋白质浓度。每孔上样量为50 μg,内参为GAPDH,后分别以80 V和120 V恒压电泳,PVDF膜转模,脱脂奶粉封闭1 h,4 ℃一抗孵育过夜,TBST清洗3次,室温孵育二抗1 h,TBST清洗后,加入ECL化学发光检测试剂,暗室X线曝光,用凝胶图像处理系统分析蛋白质表达量。

1.2.5 Transwell小室法检测细胞侵袭:胰蛋白酶消化TPC-1细胞,调整细胞浓度至5×104/mL,取200 μL无FBS细胞悬液加入Transwell上室中,取600 μL含30% FBS培养基加入下室。共培养体系培养48 h后,4%多聚甲醛固定后结晶紫染色液避光染色30 min,显微镜下随机选取5个视野进行计数并拍照保存。

1.2.6 生存期分析:用GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn/)和UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)在线搜索分析TCGA数据库中甲状腺癌组织及正常组织中的TAGLN2的表达情况;同时绘制TAGLN2的表达与甲状腺癌患者无瘤生存期之间的关系。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TCGA数据库中TAGLN2在甲状腺癌中的表达

TCGA数据库资料分析得到甲状腺组织的TAGLN2的表达如箱线图显示,TAGLN2在肿瘤组织中的表达量高于癌旁组织对照(图1A)。TAGLN2相关的无瘤生存曲线显示,TAGLN2高表达组的无瘤生存期可能更短(图1B)。

A.expression profile of TAGLN2 in tumor tissue and adjacent tissue; B.TAGLN2-related tumor-free survival curve in patients with thyroid cancer; *P<0.05 compared with adjacent tissue.

2.2 HOTAIR、miRNA-206和TAGLN2在PTC组织中的表达

与癌旁组织(adjacent tissue,AT)相比PTC组织(PTC)中HOTAIR表达量增加2.48倍,miR-206-5p降低至为原来的3/5水平,TAGLN2的转录水平和蛋白表达量均增加(P<0.05)(图2)。

AT.adjacent tissue; PTC.papillary thyroid cancer; A.HOTAIR and TAGLN2 gene expression; B.miR-206 gene expression; C.TAGLN2 protein expression; *P<0.05 compared with AT.

2.3 miR-206的增加抑制了TPC-1细胞中TAGLN2的表达

与对照组(normal control group,NC)相比,上调TPC-1细胞中miR-206的表达后,TAGLN2的表达受到抑制,转染miR-206 mimic组中TAGLN2的蛋白表达显著减少(图3)。

NC.normal control group;*P<0.05 compared with NC.

2.4 miRNA-206抑制了TPC-1细胞的侵袭能力

与对照组相比miR-206 mimic组TPC-1细胞的侵袭能力下降(73±11vs.152±20)(P<0.05)(图4)。

2.5 HOTAIR对TPC-1细胞中miR-206和TAGLN2表达的影响

干扰lncRNAHOTAIR后,TPC-1细胞中miR-206表达量增加了2.13倍,TAGLN2基因表达量降低至原来的1/2(图5A)。与对照组相比,干扰组中TAGLN2蛋白表达减少(图5B)。

a.si-HOTAIR on miR-206-5p and TAGLN2 expression; B.si-HOTAIR on TAGLN2 protein expression;*P<0.05 compared with si-NC.

2.6 LncRNA HOTAIR对TPC-1细胞侵袭能力的影响

干扰HOTAIR的表达后,TPC-1细胞的侵袭能力明显下降(图6),干扰组和对照组相比穿透小室的细胞数量明显减少(64±12vs161±15)(P<0.05)。

A,B.Transwell assay in the si-NC and si-HOTAIR group (magnification×400); C.histogram of the Transwell assay; *P<0.05 compared with si-NC group(n=6)

3 讨论

PTC的5年生存率较高,但仍有约5%～10%的肿瘤生长迅速、侵袭性高,出现复发或远处转移,因此,需要进一步了解PTC发病及侵袭转移的分子机制TAGLN2作为肌动蛋白结合蛋白Calponin家族的一员,是一种致癌基因。研究发现,TAGLN2可以调节细胞增殖、分化、迁移和凋亡[8]。通过对TCGA数据库中现有甲状腺癌组织数据分析显示,TAGLN2在癌组织中的表达量显著高于正常组织,本研究中组织样品的表达也得到了相同的结果。同时,分析表明,TAGLN2高表达可能预示患者的无瘤生存期更短。此外,研究证明,下调TAGLN2可以抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭活性[9],与本研究的实验结果一致。

miRNA在各种肿瘤中通过调控相关靶基因发挥癌基因或抑癌基因的作用,本课题组的前期研究发现,miRNA在甲状腺癌的发生发展中扮演重要作用[10]。miR-206在肿瘤进展中发挥抑制作用,许多研究报道,miR-206参与肿瘤的发病机制,但其对PTC-1细胞增殖和迁移的调控机制仍不明确。通过生物信息学分析,得出miR-206可能靶向调控TAGLN2进而在PTC中发挥重要作用。本研究证实,miR-206对TAGLN2调控作用,miR-206过表达导致TPC-1中TAGLN2的下调。同时,Transwell小室法的实验结果也显示,miR-206过表达后,PTC-1细胞的侵袭能力受到抑制。

越来越多的证据表明,lncRNA在多种生物过程的调控中发挥着重要作用。作为研究最广泛的lncRNA之一,HOTAIR已被报道在许多肿瘤中高表达,其表达水平与某些肿瘤的病理分级、临床分期和预后密切相关[11],HOTAIR在PTC组织中的高表达通常导致较差的预后[12]。而HOTAIR在PTC调控中的详细作用及其潜在机制迄今尚未完全阐明。miR-206与HOTAIR在PTC中的表达是否存在相关性尚不清楚。本研究评估HOTAIR对PTC中miR-206水平的调控作用。在PTC-1细胞或甲状腺乳头状癌组织中,高水平HOTAIR抑制miR-206的表达,下调HOTAIR表达可导致miR-206水平明显升高,同时TAGLN2表达水平随之下降,PTC-1细胞的侵袭能力下降。

综上所述,在PTC的肿瘤组织或细胞中可检测到HOTAIR高表达,miR-206低表达,TAGLN2高表达,其具有成为PTC有价值的生物标志物的潜力。此外,在甲状腺乳头状癌中,可以通过降低HOTAIR的表达水平,促成miR-206的过表达,进一步抑制TAGLN2的表达,最终达到降低甲状腺癌的侵袭能力的目的。因此,HOTAIR和TAGLN2水平的降低,miR-206水平的升高,可能有助于抑制PTC的恶性生物学行为。