张汐佳，朱兵兵，杨承霞，牛立盼，刘凤霞，2*

1.新疆医科大学 基础医学院 人体解剖学教研室，新疆 乌鲁木齐 836001；2.新疆地方病分子生物学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 836001

勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)是指患者在性行为中阴茎持续或反复无法达到令人满意的性交,是男性常见的性功能障碍之一[1]。目前,西地那非(sildenafil,Sil)是治疗ED的一线临床药物,早期治疗不仅可以逆转ED的发生发展,而且可以预防重大心血管事件的发生。研究发现,ED患者的血管发生病理性改变,主动脉损伤指数上升[2],且已经明确 ED是血管性疾病的预警因子,而炎性反应是ED和血管性疾病共同的核心机制,引发内皮功能障碍和血管组织纤维化,进一步加重ED。而焦亡是一种新型的促炎程序性细胞死亡方式,核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)的组装和激活能促进半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate-specific protease-1,caspase-1)活化、消皮素D(gasdermin D,GSDMD) 膜穿孔及白介素-1β(interleukin,IL-1β)的释放[3]。本团队前期研究发现[4-5],ED患者血清中炎性相关蛋白水平显著升高,且Sil能减少ED大鼠睾丸组织中的细胞焦亡。因此,本研究在此基础上,进一步明确Sil对ED大鼠主动脉血管组织中NLRP3/caspase-1焦亡通路蛋白表达的影响作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:SPF级6周龄雄性SD大鼠和性成熟的雌性大鼠,体质量(250 ±10)g[新疆医科大学动物实验中心,许可证:SCXK(新)2018-0003];室温 20～24 ℃,湿度约55%,饮食饮水自由,适应性饲养1周。本研究经新疆医科大学第一附属医院动物实验医学伦理委员会批准(IACUC-20280222-60)。

1.1.2 主要试剂:阿扑吗啡(APO)(西格玛企业有限责任公司);NLRP3、caspase-1、IL-1β、GSDMD一抗(Affinity公司);西地那非、BCA蛋白质定量试剂盒、蛋白质电泳试剂盒及Masson染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);总RNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司);45%高脂饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理:将大鼠随机分为对照组(control,n=10)、模型组(ED,n=45),高脂饲料诱导造模。12周后,阿扑吗啡实验筛选出ED大鼠[6]:大鼠颈部皮下注射APO(90 mg/kg)溶液后,放入安静、昏暗房间的玻璃观察箱中适应5 min,然后继续观察30 min,计时器测量1 800 s内大鼠的勃起次数和勃起潜伏期。阴茎勃起的表现为大鼠呈蹲位,阴茎体伸出并舔舐阴茎头。勃起次数为大鼠注射APO后1 800 s内阴茎勃起的次数;勃起潜伏期为注射APO后至第1次勃起的时间。实验结果随机分为ED组(n=8)、Sil组(n=8)。Sil组给予20 mg/kg西地那非灌胃 1次/天,持续14 d。

1.2.2 HE染色观察大鼠主动脉的病理学变化:将主动脉放在4%多聚甲醛中固定48 h,包埋、切片,苏木精染色4～5 min后,自来水冲洗,伊红浸染20 s,脱水、透明、封片后光镜下观察并采集图像。

1.2.3 Masson染色观察大鼠主动脉的纤维化改变:制作石蜡切片后进行Masson染色,中性树胶封片,置于显微镜下观察各组大鼠主动脉纤维化程度并拍照。

1.2.4 免疫组织化学染色检测大鼠主动脉中NLRP3和eNOS的表达:主动脉常规切片、脱蜡水化及抗原修复后,加入抗NLRP3(1∶300)一抗和抗内皮型-氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)(1∶500)一抗4 ℃孵育过夜。滴加二抗室温孵育20 min;滴加DAB显色,苏木精复染,封片后光镜下观察并采集图像,使用图像分析软件Image J进行结果分析。

1.2.5 RT-qPCR检测大鼠主动脉中NLRP3、cas-pase-1、GSDMD、IL-1β和eNOS mRNA表达水平:根据RNA提取试剂盒提取大鼠主动脉总RNA,按照试剂盒说明书进行反转录和扩增反应。根据所得Ct值计算2-ΔΔCt。引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.2.6 Western blot检测大鼠主动脉中NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β和eNOS 蛋白水平:将主动脉放入蛋白裂解液中裂解30 min后,所得上清液即为所提取的总蛋白质。根据BCA试剂盒的方法测定总蛋白质。按照每组30 μg上样量进行电泳、转膜、封闭后,加入抗NLRP3(1∶1 000)、caspase-1(1∶2 000)、IL-1β(1∶1 000)、GSDMD(1∶3 000)、eNOS(1∶3 000)、GAPDH(1∶6 000)一抗4 ℃孵育过夜,加入二抗(1∶8 000)室温孵育,显色并采集图像后测量目的蛋白及内参蛋白的吸光度值并计算比值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 勃起次数及勃起潜伏期变化

与对照组相比,ED组勃起次数降低,勃起潜伏期延长(P<0.05);与ED组相比,Sil组勃起次数升高,勃起潜伏期缩短(P<0.05)(表2)。

表2 干预期间大鼠勃起次数及潜伏期变化

2.2 主动脉组织形态变化及西地那非的干预作用

对照组大鼠主动脉管壁层次清晰,内膜表面光滑,结构完整,内皮细胞排列整齐;ED组主动脉管壁增厚且内膜表面粗糙,内皮细胞局部脱落,排列紊乱;Sil组大鼠主动脉内皮结构基本完整,内皮细胞局部脱落减少,排列较整齐(图1)。

ED.erectile dysfunction; Sil.sildenafil.

2.3 主动脉纤维化及西地那非的干预作用

与对照组相比,ED组大鼠主动脉中平滑肌纤维化增多;与ED组相比,Sil组纤维化减轻(P<0.05)(图2)。

ED.erectile dysfunction; Sil.sildenafil; 0.05 compared with control;0.05 compared with ED.

2.3 主动脉内皮功能变化

与对照组相比,ED组大鼠主动脉中eNOS mRNA降低;与ED组相比,Sil组大鼠主动脉中eNOS mRNA表达增高(P<0.05)(表3)。而eNOS主要分布在主动脉内皮细胞胞质中,与对照组相比,ED组大鼠主动脉中eNOS蛋白表达减少(图3,4,表4);与ED组相比,Sil组大鼠主动脉中eNOS蛋白表达增高(P<0.05)(图3,4,表4)。

ED.erectile dysfunction; Sil.sildenafil; 0.05 compared with control;0.05 compared with ED.

ED.erectile dysfunction; Sil.sildenafil.

表3 西地那非对大鼠主动脉组织中焦亡相关因子及eNOS mRNA表达的影响

表4 大鼠主动脉组织NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β和eNOS蛋白Western blot检测结果

2.4 主动脉中NLRP3/caspase-1焦亡相关因子mRNA表达及西地那非干预的作用

与对照组相比,ED组大鼠主动脉中NLRP3、caspase-1、GSDMD和IL-1β mRNA表达较高,eNOS mRNA表达较低(P<0.05);Sil组大鼠主动脉中NLRP3、caspase-1、GSDMD和IL-1β mRNA表达降低(P<0.05)(表3)。

2.5 主动脉中NLRP3/caspase-1焦亡相关蛋白表达及西地那非的干预作用

与对照组相比,ED组大鼠主动脉中NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达升高,与ED组相比,Sil组大鼠主动脉中NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表达降低(图4,表4)。

3 讨论

阴茎的勃起是涉及血管、神经、激素和心理因素之间的复杂作用下完成的血流动力学过程。炎性反应作为血管性疾病的核心机制,能导致ED。ED大鼠血清中IL-1β等炎性因子水平升高,导致海绵体受损进而引发ED[7]。此外,在ED小鼠阴茎海绵体中NLRP3、caspase-1和IL-1β表达也升高,引起细胞焦亡进而导致炎性反应[8],本研究也发现ED组大鼠主动脉血管组织焦亡相关因子和炎性因子IL-1β水平明显升高,表明细胞焦亡能够引起炎性反应,从而导致ED。同时也表明Sil促进ED大鼠主动脉血管组织中NLRP3/caspase-1通路蛋白的表达。作为治疗ED的经典药物,本研究探究该药可能通过抑制此通路改善ED大鼠炎性反应进而促进大鼠的勃起功能。

本研究发现ED大鼠主动脉内皮功能指标eNOS明显降低,发生内皮功能障碍。在糖尿病ED小鼠中,内源性促炎细胞因子IL-1β表达显著增高,而在使用抗炎药物干预后,主动脉内皮功能得到明显改善[9]。激活NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡会进一步诱导血管内皮损伤,加剧ED[10]。在高胆固醇血症诱导的冠心病模型小鼠中,NLRP3炎性小体的激活下调小鼠冠状动脉eNOS和NO的表达,诱发内皮功能障碍[11],同时也发现沉默NLRP3炎性小体能降低人肺动脉内皮细胞的死亡,减少内皮损伤[12]。以上研究均表明焦亡在内皮功能中发挥重要作用。本研究发现,Sil 干预可抑制ED模型大鼠主动脉血管组织中NLRP3/caspase-1焦亡通路中相关因子的表达水平,并可以改善血管内皮功能,结果提示,Sil可能通过抑制此通路减轻ED大鼠内皮功能障碍,进而促进大鼠的勃起功能。

除了内皮功能障碍外,勃起组织和血管的纤维化也是导致ED的关键因素[13]。Sil除了能显著降低男性血管性ED中促炎标志物的表达[14],并可改善肺血管扩张及纤维化程度,恢复肺功能[15]。通过靶向NLRP3炎性小体能治疗心血管纤维化[16],本研究结果也发现主动脉纤维化可促进ED,再次验证Sil可能通过IL-1β等炎性因子促进主动脉纤维化水平,并最终导致勃起功能障碍,表明Sil可通过改善纤维化来促进勃起功能的恢复。

综上所述,在Sil干预后,能改善ED大鼠主动脉内皮功能和纤维化,降低炎性因子的表达,恢复大鼠勃起功能,这可能与焦亡介导的炎性反应有关。本研究通过体内实验证明Sil改善ED大鼠的勃起功能,但这还需要通过体外实验进一步研究来证实。