张芙蓉，苟黎明，李 妍，王泽勇，杨 斐，吴 菁，覃 健*，薛 斌*

1南京医科大学附属逸夫医院中心实验室，2检验科，3骨科，江苏 南京 211166

成簇规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是一组广泛存在于细菌和古细菌中的DNA序列，Cas 序列位于其附近，编码CRISPR 相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）［1-2］。CRISPER/Cas9 技术发现细菌中存在病毒的天然基因组编辑体系，即细菌识别特定的病毒DNA 片段并对其进行切割使其失活。利用这一特性，研究人员通过设计特定的向导RNA（guide RNA，gRNA）来识别生物体基因组特定的DNA 位点并对其进行识别和切割［3］。CRISPER/Cas9 技术因其更快更高效的特点，已成为众多基因编辑技术中运用最广泛的技术［4-6］，特别是基因编辑小鼠。本研究使用CRISPER/Cas9 技术完成了基因编辑小鼠的构建。

卵磷脂胆固醇脂酰转移酶（lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT）是一种广泛存在于血浆中的酶［7］，主要由肝脏合成并分泌，对维持机体胆固醇稳态以及参与血浆中胆固醇反向转运（reverse cholesterol transport，RCT）起重要作用［7］。在胆固醇逆向转运过程中，LCAT 将游离的胆固醇进行酯化，形成的胆固醇酯经转运蛋白转运至肝脏进行代谢，从而使得外周多余的胆固醇被清除，以维持体内胆固醇平衡［8-9］。大量研究表明，体内LCAT水平或活性与众多代谢疾病密切相关［10］。LCAT 不同程度的突变及缺失会导致家族性LCAT缺乏症和鱼眼病［11-13］；此外，LCAT 水平或活性异常可导致胆固醇代谢异常，已被报道与心血管疾病和脂肪肝的发生发展有独立的相关性［14-15］。与此同时，本课题组之前的研究也证实LCAT 参与肝性骨病的调控，而具体机制需要进一步探索［16］。因此，构建肝脏特异性敲入Lcat小鼠对LCAT 作为胆固醇代谢异常疾病治疗靶点的进一步研究具有重要意义。

本研究利用CRISPR/Cas9 的技术，通过同源重组的原理设计并体外转录gRNA，同时构建同源重组载体（donor vector）。将Cas9、gRNA、donor vector同时注射到小鼠的受精卵中并获得F0 代小鼠。将测序正确的F0 代小鼠与C57BL/6JGpt 小鼠交配得到稳定遗传的F1 代小鼠后将其与肝脏特异性表达Cre的小鼠交配获得肝脏特异性敲入Lcat的小鼠。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

本研究所用小鼠品系为C57BL/6，该品系源自Abby Lathrop 小鼠株的近交品系实验鼠，所有小鼠均购自江苏集萃药康生物科技有限公司。动物实验符合南京医科大学伦理委员会的规定并被授权。所有实验小鼠均饲养于无特定病原体（specific pathogen free，SPF）环境中，光照时间为6：00～18：00（明/暗循环12 h），温度为（22±3）益，所有动物可自由饮食与活动。

1.1.2 主要试剂

2×TaqPlusMasterMix、RNA-easyIsolationReagent、HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR、2×SYBR Green MasterMix（南京诺唯赞生物科技有限公司）；蛋白酶抑制剂、RIPA 蛋白裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；PVDF 膜（Millipore 公司，美国）；鼠抗小鼠β-actin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；兔抗小鼠LCAT 抗体（武汉博士德生物有限公司）；ECL 超敏发光液（上海天能生命科学有限公司）；肝脏特异性Lcat基因过表达小鼠的DNA 鉴定引物序列信息及qPCR 引物序列见表1，所有引物合成以及测序结果均来自南京擎科生物技术有限公司。

表1 小鼠DNA鉴定及qPCR引物序列Table 1 The primer sequences for mice genotyping and qPCR

1.2 方法

1.2.1Lcat基因敲入小鼠模型的构建

利用CRISPR/Cas9 技术，将CAG-LSL-Lcat-HispolyA基因片段定点插入到小鼠的H11位点。gRNA的序列为5′-CTGAGCCAACAGTGGTAGTA-3′。将CRISPR/Cas9 体系和donor vector 显微注射到C57BL/6JGpt 小鼠的受精卵中，获得F0 代小鼠。经PCR 和测序验证正确的F0 代阳性小鼠与C57BL/6JGpt 小鼠交配获得可稳定遗传的F1 代阳性小鼠模型。将F1 代小鼠与肝脏特异性表达Cre的小鼠交配获得F2 代小鼠并对其进行基因鉴定。

1.2.2 小鼠基因型的鉴定

取上述F2 代小鼠的脚趾并使用碱提法提取基因组DNA，通过PCR 技术检测目的基因表达。PCR反应体系为2×Taq Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物均为0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反应条件为：95 益3 min；95 益15 s，65 益15 s，72 益60 s，35 个循环；72 益5 min。对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.3 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）检测小鼠不同组织Lcat基因mRNA表达

利用TRIzol 法提取组织总RNA，采用逆转录试剂盒制备cDNA，qPCR 反应体系为2×SYBR qPCR Master Mix 5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物均为0.2 μL，ddH2O 3.6 μL。反应条件为：95 益30 s；95 益10 s，60 益30 s，40 个循环；95 益15 s，60 益60 s，95 益15 s。单个样品做3 个重复，内参基因为Actb，根据公式2-ΔΔCT计算LcatmRNA 在不同组织中的表达水平。

1.2.4 Western blot 验证小鼠不同组织LCAT 蛋白水平

颈椎脱臼法处死野生型和肝脏特异性敲入Lcat的小鼠后，依次提取各组织并剪取30 mg 放入含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液中，研磨，12 000 r/min 离心15 min 取上清，加入上样缓冲液后100 益金属浴8 min，提取总蛋白。在120 V 电压下经SDS-PAGE胶分离蛋白，湿转法将蛋白转至PVDF 膜上，使用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h 后孵育一抗（LCAT 稀释比为1∶1 000，β-actin 稀释比为1∶10 000），4 益摇床孵育过夜后用PBST 洗3×10 min，二抗1∶10 000稀释后室温孵育1 h，PBST 洗3×10 min 后显影成像，使用Image J 对Western blot 条带的灰度值进行统计分析。

2 结果

2.1 小鼠Lcat基因修饰靶点gRNA序列设计及表达载体构建

由于小鼠第11 号染色体上的H11位点位于Eif4enif1与Drg1这两个基因之间，且外源基因插入后对内源基因表达影响较小，因此针对H11位点合成gRNA序列。采用CRISPR/Cas9技术将CAG-LSLLcat-His-polyA 片段基因片段定点插入到小鼠的H11位点上。载体结构见图1。

图1 载体结构示意图Figure 1 Diagram of carrier structure

2.2 肝脏特异性敲入Lcat小鼠基因型鉴定

将F0 代小鼠与C57BL/6JGpt 小鼠交配获得F1代小鼠，对1 周内的F1 代小鼠进行剪趾并提取DNA 后进行PCR，核酸电泳结果中F1代杂合子H11和H11-wt均有条带显示（图2A）。后将F1代杂合子与Alb-iCre小鼠交配得到肝脏特异性敲入Lcat小鼠。核酸电泳结果中H11、H11-wt和Cre均有条带显示（图2B）。

图2 F1代和F2代小鼠基因型鉴定结果Figure 2 Identification of genotype in F1 and F2 mice

2.3 肝脏特异性敲入Lcat 小鼠不同组织的Lcat mRNA水平

为确定小鼠各组织Lcat转录水平的差异，根据核酸电泳结果，筛出基因型带Cre的敲入（knock-in，KI）小鼠，以未携带Cre的KI/WT 或KI/KI 鼠作为对照，依次提出心脏、肝脏、肾脏、脑、棕色脂肪的RNA，将其进行逆转录，并将得到的cDNA 进行qPCR，结果以小鼠心脏内Lcat表达为比较基准，提示在对照组小鼠中，Lcat主要由肝脏特异性表达，而在肝脏特异性敲入Lcat小鼠的肝脏内，Lcat的RNA 水平显著增加（图3）。

2.4 肝脏特异性敲入Lcat小鼠不同组织的LCAT蛋白水平

为探究肝脏特异性敲入小鼠与对照组相比各组织LCAT蛋白水平的差异，依次提取各组织蛋白，并通过Western blot检测LCAT的表达差异。结果显示，在肝脏特异性敲入Lcat小鼠体内，除肝外，心、肾、脑和脾中也出现了LCAT 的高水平表达（图4）。提示LCAT 作为一种分泌性蛋白，可通过血液循环运输到其他组织中。

图4 Western blot检测Lcat CKI小鼠组织中蛋白表达情况Figure 4 The relative expressions of proteins in multiple tissues of Lcat CKI mice detected by Western blot

3 讨论

CRISPER/Cas9是近年来发现的一种特定、高效和多功能的基因编辑技术［17］。利用CRISPER/Cas9对DNA的特定区域进行插入、缺失和替换已广泛运用于基因过程领域并进一步参与疾病的研究与治疗中［18-20］。CRISPER/Cas9 体系主要由Cas9 酶和gRNA构成。当gRNA与Cas9结合后，在gRNA的引导下，Cas9 完成对指定序列位点的切割。利用CRISPER/Cas9技术完成了基因编辑小鼠的构建，从而对特定基因在相应疾病模型中发挥的作用进行体内研究。

LCAT 作为胆固醇代谢中不可缺少的酶，在脂代谢异常中的作用已被广泛研究。如Scarpioni等［21］发现LCAT缺乏的患者动脉粥样硬化风险显著升高。Gebhard 等［22］通过经冠状动脉造影证实冠心病患者血浆LCAT 质量浓度升高，且与斑块体积呈负相关，提示LCAT 有动脉粥样硬化保护作用。在动脉粥样硬化负荷的风险预测模型中，LCAT 质量浓度优于LCAT活性，表明LCAT质量是动脉粥样硬化保护的关键变量。因此，进一步评估LCAT 作为心血管疾病治疗靶点的研究是有必要的。

另一方面，Janac 等［23］对130 例患者进行了脂肪肝指数分类，发现较高的LCAT 活性与脂肪肝指数升高有关。类似的还有Nass 等［15］对348 例受试者的研究中发现，LCAT 活性升高与脂肪肝指数升高独立相关，而具体机制尚不清楚。同时，本课题组前期研究显示，Pp2a敲除小鼠导致的LCAT升高对肝性骨病有明显缓解与改善作用［16］。而与之前报道的小鼠全身性转入人Lcat基因相比［24］，本课题首次将鼠源的Lcat特异性敲入小鼠肝脏，具有明显的创新性。因此，本课题构建的肝脏特异性敲入Lcat小鼠对研究动脉粥样硬化、脂肪肝以及肝性骨病的具体发病机制和靶点的选择具有重要意义。