APP下载

靶向MPO的次氯酸荧光探针用于细胞成像

2023-10-29徐辉军王玉婷秦亚娟厉廷有

关键词:次氯酸柱层析孵育

徐辉军,王玉婷,秦亚娟,厉廷有

南京医科大学药学院,江苏 南京 211166

髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)介导吞噬体内卤代氧化剂的产生,在细菌杀伤,保护身体免受疾病侵害中起关键作用[1]。Chen 等[2]研究发现MPO 活性与脑卒中相关,在短暂性大脑中动脉闭塞(transience middle cerebral artery occlusion,tMCAO)和永久性大脑中动脉闭塞(permanent middle cerebral artery occlusion,pMCAO)动物模型中,缺血皮层中的MPO 活性在缺血开始6 h 升高,在第5 天达到峰值,并在第15天逐渐恢复到基础水平。对缺血性卒中模型使用MPO 抑制剂KYC 可以减小脑梗死体积,保护血脑屏障,减轻神经缺损[3-5]。大量研究表明MPO 可以作为脑卒中的标志物,且MPO 抑制剂可以用于治疗脑卒中。

次氯酸(hypochloric acid,HClO)常被认为是中性粒细胞介导的细胞内杀伤微生物的活性物质。当过氧化氢存在时,Fe3+-MPO(天然酶)经历双电子氧化,形成化合物Ⅰ(·+por-Fe[IV]=O)和H2O。化合物I 可以通过卤化物(Cl-、Br-、I-,但不包括F-)或假卤化物(SCN-)的双电子还原转化为天然酶,在还原过程中产生各自的次卤酸(HClO、HBrO、HIO 或HOSCN),且由于血浆中Cl-的浓度远远高于其他卤化物,所以HClO 是MPO 卤化循环中最丰富和最重要的产物[6]。脑卒中发生后,MPO 被激活,引发HClO大量产生。

近年来,HClO 荧光探针的研究取得了显著进展,虽然已发表的探针在体外对HClO 均有很好的灵敏度、选择性、稳定性,且在细胞实验中获得了优秀的检测效果,然而其较短的激发和发射波长(一般情况下λex<600 nm,λem<650 nm)会带来多种问题,如可能会受到体内自身荧光信号的干扰、对生物样品产生光毒性以及可能出现光漂白现象等[7-8]。且它们没有靶向检测MPO 的能力,在体内使用受到限制。

本文以具有高光稳定性和近红外发射能力的硅罗丹明为荧光基团,通过酰肼硫脲键连接MPO的靶向基团KYC 合成SiRho-GABA-KYC(图1)[9-10]。HClO存在时硅罗丹明-硫氨基脲会发生环化反应并产生显著的荧光启动反应[11]。该探针可在体外特异性检测HClO,可用于细胞成像。

图1 探针SiRho-GABA-KYC结构Figure 1 The structure of SiRho-GABA-KYC

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和仪器

1H NMR、13C NMR(400 MHz 核磁共振仪,JEOL公司,日本);质谱(Agilent-6410 LC/MS,Agilent 公司,美国);硅胶板(薄层层析用,青岛化工研究所);多功能酶标仪(SYNERGY H1,BioTek 公司,美国);气浴恒温振荡器(CHA-S THZ-82 ZD-85,江苏正基仪器有限公司);台式低速冷冻离心机(CenLee 5R,湖南湘立科学仪器有限公司);CO2培养箱(HERAcell 150i,Thermo Scientific 公司,美国);紫外分光光度计(UV-2450,Shimadzu 公司,日本);荧光分光光度计(FL-4600,Hitachi 公司,日本);激光共聚焦显微镜(LSM 800,Zeiss公司,德国)。化学试剂除特殊说明外均为市售试剂。

1.1.2 细胞系与培养条件

HeLa细胞常规培养于含10%胎牛血清,80 U/mL青霉素,0.08 mg/mL 链霉素的DMEM 培养基,置于5%CO2,37 益的培养箱中。

1.2 方法

1.2.1 化合物的合成

化合物的合成方法如图2所示。

图2 化合物的合成方法Figure 2 Synthetic scheme for the compounds

1.2.1.1 xhj-2-1的合成

于氩气保护下,将3-溴-N,N-二甲基苯胺(10 g,50 mmol)溶于30 mL 无水四氢呋喃(THF)中,冷却至-78 益,加入正丁基锂(n-BuLi)(2.5 mol/L 的己烷溶液,22 mL,55 mmol),反应2 h 后,加入二氯二甲基硅烷(3.6 mL,30 mmol),升温至室温继续反应2 h。反应结束后,加冰水淬灭,减压浓缩除尽THF 后用乙酸乙酯(EA)萃取3 次,合并有机层,加无水硫酸钠(Na2SO4)干燥。有机相减压浓缩后通过硅胶柱层析[石油醚(PE)∶EA=50∶1]得浅黄色油状液体4.8 g,产率:64.34%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.25(d,J=5.6 Hz,1H),7.22(d,J=7.8 Hz,1H),6.93(d,J=2.7 Hz,2H),6.91(d,J=7.1 Hz,2H),6.76(dd,J=8.3,2.4 Hz,2H),2.92(s,12H),0.53(s,6H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:150.13,139.15,128.68,122.94,118.53,113.76,40.89,-1.95。高分辨质谱(HRMS)[离子源类型(ESI)]m/z:299.23[M+H]+。

1.2.1.2 xhj-2-2的合成

将xhj-2-1(1 g,3.35 mmol),2-羧基苯甲醛(2.52 g,16.8 mmol)和溴化铜(CuBr2)(75 mg,0.34 mmol)置于耐压管中,升温至140 益搅拌5 h。反应结束后,反应液冷却至室温,二氯甲烷(DCM)稀释后调节pH至碱性,用DCM 萃取3 次,收集有机相,无水Na2SO4干燥后减压浓缩,通过硅胶柱层析(PE∶EA∶Et3N=50∶1∶1)得粗品,再次通过硅胶柱层析(PE∶DCM=1∶10),所得粗品用EA/PE(石油醚)重结晶得淡蓝色固体300 mg,产率:20.86%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.95(d,J=7.6 Hz,1H),7.62(td,J=7.5,1.0 Hz,1H),7.53(dd,J=11.1,3.9 Hz,1H),7.29(d,J=7.7 Hz,1H),6.96(d,J=2.7 Hz,2H),6.78(d,J=8.8 Hz,2H),6.54(dd,J=8.9,2.8 Hz,2H),2.95(s,12H),0.64(s,3H),0.60(s,3H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:170.90,154.57,149.44,137.17,133.85,128.86,128.34,127.21,125.82,124.76,116.79,113.48,92.06,40.48,0.63,-1.32。HRMS(ESI)m/z:429.22[M+H]+。

1.2.1.3 xhj-2-3的合成

将xhj-2-2(44 mg,0.10 mmol)溶于5 mL 乙醇(EtOH)中,升温至80 益,加入85%水合肼(0.2 mL,3.48 mmol),搅拌回流4 h,反应结束后减压浓缩。浓缩液用EA 稀释,饱和食盐水洗涤3 次,收集有机相,加无水Na2SO4干燥。有机相减压浓缩后通过硅胶柱层析(PE∶EA=3∶1)得8 mg 无色油状液体,产率:17.63%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.95~7.86(m,1H),7.34~7.26(m,2H),6.89(d,J=2.8 Hz,2H),6.88~6.85(m,1H),6.73(d,J=9.0 Hz,2H),6.63(dd,J=9.0,2.9 Hz,2H),3.68(s,2H),2.94(s,12H),0.60(s,3H),0.57(s,3H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:167.79,153.66,149.02,135.79,132.59,130.33,128.82,127.90,127.48,123.83,122.95,116.19,115.34,73.72,40.43,1.12,0.27。HRMS(ESI)m/z:443.26[M+H]+。

1.2.1.4 isoGABA的合成

将二硫化碳(1.74 mL,28.93 mmol)加入到γ-氨基丁酸(GABA)(1 g,9.7 mmol)和Et3N(3.4 mL,24.5 mmol)的THF/H2O(7 mL/7 mL)溶液中,于室温搅拌14 h 后,冷却至0 益,缓慢滴加碘(I2)(2.7 g,10.6 mmol)的THF(7 mL)溶液,滴加完毕后于0 益继续反应3 h。反应结束后,向反应液加入6 mL 2 mol/L稀盐酸 和Na2SO3(0.24 g,1.9 mmol),加 入EA 分层,取有机层减压浓缩后通过硅胶柱层析(PE∶EA=2∶1)得浅棕色油状液体1.34 g,产率:95.2%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:9.32(s,1H),3.67~3.55(m,2H),2.50(dd,J=9.0,5.3 Hz,2H),2.06~1.90(m,2H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:178.69,131.06,44.35,30.83,25.04。

1.2.1.5 SiRho-GABA-OH的合成

将xhj-2-3(550 mg,1.24 mmol)和isoGABA(4.32 g,29.76 mmol)溶于干燥无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(20 mL)中,在氩气保护下于90 益搅拌过夜,通过TLC 监测反应。反应完成后,冷却至室温,EA反复萃取3 次,收集有机层。有机层用饱和食盐水冲洗3 次后,无水Na2SO4干燥,减压浓缩后通过硅胶柱层析(PE∶EA=1∶1)得淡绿色固体440 mg,产率:60.2%。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.97(d,J=7.1 Hz,1H),7.63~7.51(m,2H),7.12(d,J=7.5 Hz,1H),6.88(s,1H),6.83(d,J=2.8 Hz,2H),6.56(dd,J=9.0,2.9 Hz,2H),6.48(d,J=8.9 Hz,2H),5.72(t,J=5.8 Hz,1H),3.22(dd,J=13.0,6.7 Hz,2H),2.92(s,12H),2.08~1.99(m,2H),1.44~1.32(m,2H),0.53(d,J=4.3 Hz,6H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ:182.91,177.83,168.00,153.26,149.24,137.95,134.40,129.88,129.35,129.20,128.72,124.72,123.93,115.92,114.76,73.75,43.92,40.22,31.07,23.83,0.36,-0.59。质谱MS(ESI)m/z:586.41[M-H]-。

1.2.1.6 SiRho-GABA-KYC的合成

树脂溶胀:称取Rink Amide 树脂(0.97 g,0.71 mmol),加入DMF(9 mL)充分振摇使溶胀树脂,30 min后抽干DMF。DMF洗涤6次,振摇5 min/次。

肽键的形成:加入含20%哌啶的DMF(9 mL),振摇5 min,抽干;再次加入相同的DMF溶液(9 mL),振摇40 min,抽干;DMF 洗涤6 次。加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(2.5 eq,1 038 mg),六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)(2.5 eq,927 mg),1-羟基苯并三唑(HOBT)(2.5 eq,240 mg),N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(4.0 eq,472 μL),DMF(9 mL),26 益恒温振摇4 h。抽干,DMF 洗涤6 次,每次振摇5 min,抽干。

二肽:加入含20%哌啶的DMF(9 mL),振摇5 min,抽干;再次加入相同的DMF 溶液(9 mL),振摇40 min,抽干;DMF 洗涤6 次。加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(2.5 eq,815 mg),PyBop(2.5 eq,927 mg),HOBT(2.5 eq,240 mg),DIPEA(4.0 eq,472 μL),DMF(9 mL),恒温26 益振摇4 h。抽干,DMF 洗涤6 次,振摇5 min/次,抽干。

三肽:加入含20%哌啶的DMF(9 mL),振摇5 min,抽干;再次加入相同的DMF 溶液(9 mL),振摇40 min,抽干;DMF 洗涤6 次。加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(2.5 eq,834 mg),PyBop(2.5 eq,927 mg),HOBT(2.5 eq,240 mg),DIPEA(4.0 eq,472 μL),DMF(9 mL),恒温26 益振摇4 h。抽干,DMF 洗涤6 次,振摇5 min/次,抽干。

四肽:加入含20%哌啶的DMF(9 mL),振摇5 min,抽干;再次加入相同的DMF 溶液(9 mL),振摇40 min,抽干;DMF 洗涤6次。加入SiRho-GABAOH(1.05 eq,440 mg),PyBop(1.2 eq,460 mg),HOBT(1.2 eq,120 mg),DIPEA(2.0 eq,236 μL),DMF(9 mL),恒温26 益振摇4 h。抽干,DMF 洗涤6 次,振摇5 min/次,抽干。

树脂后处理:DMF 洗涤3 次,DCM 洗涤3 次,MeOH 洗涤3 次,DCM 洗涤3 次,MeOH 洗涤洗涤3 次,振摇5 min/次,洗涤后放入真空干燥器充分干燥。

在上述充分干燥的树脂中加入三氟乙酸(9.5 mL)和三异丙基硅烷(0.5 mL),恒温26 益振摇2 h,抽滤,滤液保存待用。此步骤重复2 次,合并3 次切割所得滤液,减压浓缩至小体积,加入冰乙醚析出沉淀,过滤干燥得粗品。溶解后用液相进行半制备。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.65(s,1H),8.00(dd,J=11.0,8.0 Hz,2H),7.90(d,J=6.9 Hz,1H),7.83(d,J=7.8 Hz,1H),7.76~7.56(m,5H),7.24(d,J=13.6 Hz,2H),7.04~6.93(m,5H),6.72~6.27(m,6H),2.97(dd,J=16.0,5.4 Hz,3H),2.89(d,J=3.2 Hz,12H),2.83~2.67(m,5H),2.25~2.18(m,1H),1.87(t,J=7.2 Hz,2H),1.63~1.35(m,4H),1.21(d,J=6.9 Hz,4H),0.49(d,J=14.1 Hz,6H)。MS(ESI)m/z:491.34[1/2M+H]+。

1.2.2 活性测试

1.2.2.1 光谱测量

紫外测定:在PBS(50%DMF,pH 5.0)中,SiRho-GABA-KYC(5 μmol/L)与HClO(50 μmol/L,PBS)于37 益孵育30 min后检测紫外吸收光谱。

荧光测定:在PBS(50%DMF,pH 5.0)中,SiRho-GABA-KYC(5 μmol/L)与HClO(50 μmol/L,PBS)于37 益孵育30 min后,检测激发光谱和发射光谱。

pH 稳定性:在不同pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.4、8.0、8.5)的PBS 缓冲液(50% DMF)中,SiRho-GABA-KYC(5 μmol/L)与HClO(50 μmol/L)于37 益孵育30 min后,用620 nm激发检测波长681 nm处的荧光强度。

浓度依赖性:在PBS(50% DMF,pH 5.0)中,SiRho-GABA-KYC(5 μmol/L)与HClO(0、0.25、0.50、0.75、1.00、2.50、5.00、10.00、20.00、25.00、40.00、50.00 μmol/L)于37 益孵育30 min后检测荧光光谱。

选择性:在PBS(50% DMF,pH 5.0)中,SiRho-GABA-KYC(5 μmol/L)与不同底物(50 μmol/L)于37 益孵育30 min后,用620 nm激发检测波长681 nm处的荧光强度。各组底物:①Control;②H2O2;③HBrO;④·OH;⑤tBuOO·;⑥ROO·;⑦TBHP;⑧ONOO-;⑨NO;⑩ NO;⑪ NO;⑫ Na+;⑬ K+;⑭ Ca2+;⑮ Mg2+;⑯ Zn2+;⑰ Cu2+;⑱ Fe3+;⑲ Cl-;⑳ I-;㉑ Arg;㉒ Gly;㉓ Glu;㉔ Cys;㉕ H2S;㉖ GSH;㉗ HOCl。

1.2.2.2 细胞毒性

取处于对数生长期的HeLa 细胞制成悬液并接种到96 孔板中(细胞密度约为5×104个/孔),于37 益,5% CO2的孵育环境中培养12 h,加入SiRho-GABA-KYC溶液(相当于细胞培养基中浓度为0、5、10、20、30、50 μmol/L),另设空白组(无细胞),每组设6 个复孔,于培养箱中继续孵育24 h,弃去上清液,加入100 μL无血清培养基和10 μL CCK-8溶液,继续培养1 h 后,在酶联免疫检测仪波长450 nm 处测量各孔的吸光值。

1.2.2.3 外源性HClO细胞成像

取处于对数生长期的HeLa 细胞制成悬液,加入到预先放置盖玻片的24孔板中,于37 益,5%CO2培养箱中培养12 h,弃去培养基,用PBS缓冲液清洗1 次,加入不同浓度的次氯酸钠(相当于细胞培养基中浓度为0、5、10、15、20、30 μmol/L)和opti-MEM 预孵育30 min后,更换opti-MEM,然后加入SiRho-GABA-KYC(细胞培养基中浓度为10 μmol/L,1%DMF)和Hoechst 33258(8 μmol/L)孵育30 min后,弃去上清液,用PBS 缓冲液清洗细胞3 次,加4%多聚甲醛于室温下固定15 min后,用PBS清洗3次,取出盖玻片,细胞贴壁面朝下置于载玻片(滴加5 μL 抗荧光猝灭剂)上,盖玻片四周用指甲油密封,避光,使用Zeiss LSM 800激光共聚焦显微镜观察拍照。

1.3 统计学方法

实验数据结果采用GraphPad Prism7软件分析,符合正态分布的定量数据以均数±标准差()表示。两组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 探针的光谱特性

SiRho-GABA-KYC 加入HClO后,如图3A所示,紫外最大吸收波长位于660 nm。随后检测SiRho-GABA-KYC 与HClO 反应后的荧光发射,如图3B 所示,探针SiRho-GABA-KYC 和HClO 反应后,其最大激发波长位于660 nm,最大发射波长位于681 nm,但是使用660 nm 激发会影响发射光谱,所以使用620 nm作为激发波长。

图3 SiRho-GABA-KYC的光谱特性Figure 3 Spectral characteristics of SiRho-GABA-KYC

2.2 探针对HClO的浓度依赖性

检测SiRho-GABA-KYC 与不同浓度HClO 反应的荧光发射,如图4A 所示,发现随着HClO 浓度(0~25 μmol/L)的升高,荧光也逐渐增强。将681 nm处的荧光强度与HClO浓度(0~50 μmol/L)进行线性拟合,如图4B 所示,HClO 在0~25 μmol/L 的浓度范围内存在良好的线性关系(y=276.5x+70.51,R2=0.996)。

图4 SiRho-GABA-KYC的浓度依赖性Figure 4 Concentration dependence of SiRho-GABA-KYC

2.3 探针对pH的稳定性

为了检测探针在不同pH 环境中的稳定性及检测HClO 的效果,测定了pH 从4.0~8.5 共10 个pH 的纯探针以及与次氯酸反应的荧光强度。如图5 所示,探针本身在不同pH 的缓冲液中荧光强度基本不发生变化,说明探针受pH变化的影响很小,对pH稳定。当探针用于检测HClO 时,在pH 值为5.0 时荧光最强,于生理pH(7.35~7.45)范围时,探针对HClO仍有较强响应,因此该探针适用于细胞及体内成像。

图5 SiRho-GABA-KYC的pH稳定性Figure 5 pH stability of SiRho-GABA-KYC

2.4 探针对HClO的选择性

为了验证探针检测HClO 的选择性,对该探针与其他可能会与探针反应的活性氧或活性氮(H2O2、HBrO、·OH、tBuOO·、ROO·、TBHP、ONOO-、NO、、),生物硫醇(Cys、H2S、GSH),金属离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+),卤素离子(Cl-、I-)和氨基酸(Arg、Gly、Glu)的响应活性进行了检测,如图6 所示。探针对HClO 的选择性优于其他生物相关分子,只有HClO促进了荧光发射的显著增强,而在其他底物的存在下,探针的荧光光谱没有观察到明显的变化。在681 nm 处,探针对HClO 响应后的荧光增强相较其他检测底物>30倍。

图6 SiRho-GABA-KYC的选择性Figure 6 Selectivity of SiRho-GABA-KYC

2.5 探针的响应机制

氧(硅)杂蒽螺环开环是检测次氯酸常用的一个识别基团,依照已有的研究猜测,它与HClO反应后,硅罗丹明-氨基硫脲基团成环,氧(硅)杂环形成共轭结构,如图7所示。

图7 SiRho-GABA-KYC与HClO的响应机制图Figure 7 Response mechanism of SiRho-GABA-KYC with HClO

为了研究探针与次氯酸是否如预期反应,设计此实验。现设置如下3组实验:①探针溶液,②探针与HClO 混合溶液,③产物溶液,在37 益孵育5 min后,使用液相进行分析,收集探针与目标产物的信号(图8)。探针与次氯酸的混合溶液中出现的新峰与产物峰保留时间一致,说明探针与次氯酸按照设想的机制进行反应。

图8 HPLC分析结果Figure 8 HPLC analysis

2.6 细胞毒性

用CCK-8 比色法进行探针的细胞毒性实验。结果如图9,HeLa 细胞与50 μmol/L 以下的SiRho-GABA-KYC孵育24 h后,细胞存活率超过90%,表明SiRho-GABA-KYC对HeLa细胞的毒性很小,生物相容性好,细胞对10 μmol/L的探针是完全可以耐受的。

图9 SiRho-GABA-KYC对HeLa细胞活力的影响Figure 9 Effect of SiRho-GABA-KYC on relative of cell viability of HeLa cells

2.7 外源性次氯酸成像

为了考察探针对细胞中外源性HClO 的成像能力,用不同浓度的HClO 处理HeLa 细胞(图10)。荧光强度随外源性HClO 浓度升高而增强,加入30 μmol/L HClO 孵育的荧光强度比对照组增强>2 倍,表明探针能够有效检测HeLa 细胞的外源性HClO,且与HClO呈浓度依赖性增强。

图10 SiRho-GABA-KYC对细胞中外源性HClO的成像能力Figure 10 Imaging ability of SiRho-GABA-KYC for exogenous HClO in cells

3 讨论

HClO 是氧化应激中非常重要的一类生物标志物,它的过量产生与多种疾病密切相关。脑卒中发生后,MPO 表达量和催化活性上调,HClO 生成增加。目前,HClO 荧光探针的研究取得了显著进展,虽然这些HClO 探针在体外对HClO 均有很好的灵敏度、选择性、稳定性,但没有靶向检测MPO 的能力。在此前提下,设计合成了SiRho-GABA-KYC。该探针对HClO 响应较高,选择性好。细胞实验结果表明探针对细胞毒性小,对细胞外源性的HClO有较好的检测能力。希望可以对该探针进行深入的研究,用于生物活体成像,以期最终应用于脑卒中的诊断和治疗。

猜你喜欢

次氯酸柱层析孵育
次氯酸水在消毒领域的应用及注意事项
多功能荧光探针用于次氯酸及微环境检测
微酸性次氯酸对番茄灰霉病和灰叶斑病的抑制作用
泥炭组成成分的GC-MS分析
三物黄芩汤组分(群)配伍在大鼠肝微粒体孵育模型中的相互作用
柱层析用硅胶对羌活中主要成分的影响
“次氯酸分解的数字化实验”设计说明
大鼠肝微粒体孵育体系中2种成分的测定及其代谢
厚朴酚中压硅胶柱层析纯化工艺的优化
精子与慢病毒孵育制备转基因猪的分子检测及遗传分析