张 娟， 许 力， 张文鹏， 孙 琦， 奚江波

（1.武汉工程大学化学与环境工程学院，武汉 430205；2.清华大学机械工程学院，北京 100084）

0 引言

近年来，为响应国家培养创新型人才的号召，各高校均相应增加了仪器分析实验教学学时。事实上，实验教学相对于理论教学来说更加直观，更能发挥学生的主观能动性，是培养学生知识创造能力、应用能力和实践能力的重要环节［1-3］。而传统的仪器分析实验课程教学大多聚焦仪器的操作使用方法，实验内容选题不具有吸引力，多为单一性的验证性实验，缺乏应用型实验设计案例，导致学生学习主观能动性不高。仪器分析实验课程教学应该与科研工作紧密结合，从现实问题出发，设计和建立实验方案，完成实验的整个过程，让学生体验科研实践工作的重要性。笔者及团队成员长期从事仪器分析教学和科研的相关工作，在磁性固相萃取［4-6］、管内固相萃取［7-8］、固相微萃取［9］结合色谱分析法用于生物标记物、抗生素残留、环境污染物等化合物的分析和检测方面积累了大量的经验，这些都为培养学生实践、探索和创新能力提供了有力支撑。

多环芳烃（PAHs）是一类含2 个或2 个以上苯环组成的有机污染物，可通过大气、水体和食物摄取等方式进入人体，具有遗传毒性、突变性和致癌性，因此检测水体中的多环芳烃对人类生命健康具有重要意义［10］。气相色谱法是分析有机环境污染物最为常用的方法，具有灵敏度高、分析速度快等优点［11-12］。然而，由于实际样品基质中PAHs的含量较低，需要通过样品前处理技术对样品富集浓缩后才能被检测到。固相微萃取（SPME）是一种及采样、浓缩、进样、分析于一体的重要的样品前处理技术，它具有操作简单、无须使用溶剂、对环境友好、重现性好等优点［13］，非常适合于用于本科生教学实验。目前SPME技术在本科生实验中还未涉及，本实验将SPME 技术与气相色谱-氢火焰离子化检测器（GC-FID）结合引入本科仪器分析实验中，采用廉价易得的铅笔芯作为涂层材料制备SPME探针，结合气相色谱用于检测环境水中的污染物PAHs，该实验设计使学生充分了解SPME探针的制备、样品前处理、气相色谱分离和定量检测整个分析流程。通过较为简单的实验，获得实际环境样本中污染物的含量信息，激发学生对检测技术的兴趣。该实验选题贴近生活，使学生充分意识到环境污染问题的严重性，增强学生的环境保护意识，让学生学以致用，真真切切感受到仪器分析实验的重要性，在对实验原理和流程完全理解和掌握的基础上，培养学生分析问题和解决问题的能力，拓宽学生的专业视野，培养综合思维以及创新能力［14-16］。

1 实验教学目标与安排

本实验项目定位为综合性或开放性仪器分析实验。实验时长8 学时，教学组织方面可以采用2 人1组或4 人1 组，要求学生共同设计实验方案并分工协作。第1 阶段（2 学时）：任课教师讲解实验原理、仪器操作和实验注意事项，重点引导学生熟悉实验内容和方案。学生配制相关溶液，制备固相微萃取探针，掌握气相色谱仪的原理和操作。第2 阶段（2 学时）：学生按分组进行顶空固相微萃取条件和解吸条件的优化。第3 阶段（4 学时）：学生在最佳萃取条件和解析条件下，测定不同浓度的混合PAHs标准溶液，进行方法学考察，建立分析方法。利用本实验建立的方法，对湖水、雨水、自来水中的PAHs 进行分析测定，并进行加标回收率实验，考察方法的准确性。学生按分组自愿选择其中一种水样进行测定，并进行加标回收率实验。

2 实验方法

2.1 仪器与试剂

仪器：气相色谱仪（Agilent 7820A），配备氢火焰离子化检测器，HP-5 毛细管色谱柱（30 m × 0.32 mm（i.d.）× 0.25 μm），商品化固相微萃取手柄，离心机，超声波清洗仪，UPDR-II-20L超纯水制取系统。

试剂：多环芳烃包括萘（Nap），苊烯（Any），苊（Ana），芴（Flu），菲（Phe）均购自阿拉丁试剂公司，湖水采自校园内静思湖，甲醇购自国药集团，2B 铅笔购自学校超市，实验用水均为超纯水。

2.2 标准溶液的配制

分别准确称取10 mg的Nap、Any、Ana、Flu、Phe置于10 mL的容量瓶中，加入少量甲醇溶解，再用甲醇稀释定容，配置成质量浓度为1 mg/mL 的标准储备液，置于4℃冰箱保存。分别取1 mL 上述标准储备液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容后得到浓度为100μg/mL的混合标准品溶液。用甲醇逐级稀释成浓度为50、20、10、5、2、1、0.5、0.2 μg/mL 的系列混合标准工作液。

2.3 色谱条件

色谱条件：设定进样口温度为280 ℃，检测器温度为300 ℃；升温程序，初温45 ℃保持1 min，然后以15℃/min升至130 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min 升至280 ℃；载气为高纯氦气（纯度≥99.99%），流速2 mL/min；空气流速为250 ml/min；不分流模式。

2.4 铅笔芯固相微萃取探针的制备

取2B铅笔，用小刀刮下铅笔芯，玛瑙研钵碾碎，用甲醇、水分别洗涤数次，离心分离后于100 ℃下真空（-0.1 MPa）干燥0.5 h 得到铅笔芯粉末。取市售2 cm不锈钢丝（直径为0.1 mm）一段约1 cm 用砂纸打磨粗糙后，分别用甲醇和水清洗，于60 ℃烘箱中干燥后备用。称取0.5 g硅酮密封胶用1 mL环己烷稀释，将一端经处理的不锈钢丝插入上述溶液中5 s 后取出，随后立即插入到铅笔芯粉末中，取出后于称量纸上旋转按压得到均匀的涂层，将其放入60 ℃烘箱中加热10 min除去残留的溶剂，将涂敷有铅笔芯的不锈钢丝固定在SPME不锈钢套管的内管中，最后将该探针插入气相色谱进样口280 ℃老化1 h，得到铅笔芯固相微萃取探针。

2.5 顶空固相微萃取实验和水样的处理

用铅笔芯固相微萃取探针对PAHs混合标准溶液进行SPME实验，SPME流程如图1 所示。取20 μL浓度为50 μg/mL 的PAHs混合标准溶液于密封的玻璃瓶中，加水稀释至20 mL 得到浓度为0.05 μg/mL 的PAHs水溶液，将铅笔芯固相微萃取探针插入该密封玻璃瓶的溶液上方，溶液磁力搅拌，萃取完成后，将涂层收回到内管并拔出探针，迅速插入气相色谱进样口并推出涂层热解吸，气相色谱仪检测信号。对学生进行分组，优化萃取和解析条件，每组学生选做一个条件的优化实验，每个条件自主选取5 个点，分别考察萃取时间（5 ～50 min）、萃取温度（20 ～70 ℃）、水溶液中NaCl盐浓度（质量分数）（0 ～30%）和解析时间（1 ～10 min）对萃取性能的影响，以确定最佳萃取条件和解析条件。

图1 顶空SPME流程示意图

实际样品为湖水、河水等天然水源，用0.45 μm微孔滤膜过滤后直接采用上述流程进行分析。

3 结果与讨论

3.1 铅笔芯涂层的表征

用场发射扫描电镜（FESEM）对涂层表面形貌进行了表征。如图2 所示，裸蚀刻的不锈钢丝表面较为光滑，而涂覆铅笔芯粉末后，不锈钢丝表面呈现粗糙多孔状、且涂层分布均匀，表明铅笔芯涂层均匀的涂敷到不锈钢丝表面。FESEM测试由老师操作完成。

图2 蚀刻不锈钢丝（a）和涂敷铅笔芯的不锈钢丝（b）FESEM图像（×200）

3.2 萃取条件和解析条件优化

3.2.1 萃取时间的选择

萃取时间直接影响探针对PAHs 萃取性能的好坏，选取5 个不同萃取时间（10、20、30、40、50）min，考察萃取时间对PAHs萃取性能的影响。学生通过不同萃取时间下，气相色谱分离得到的PAHs色谱图的峰面积进行比较分析。如图3 所示，随着萃取时间从10 min增加到50 min，Nap、Any 和Ana 的峰面积没有明显变化，这是由于对于相对分子质量小的、具有相对高扩散系数的PAHs，吸附剂对其吸附平衡时间较短；而Flu和Phe的峰面积随着萃取时间的增加先增加后基本保持不变，这是由于对于苯环多的相对分子质量较大的PAHs，其具有相对较低的扩散系数，与低相对分子质量的多环芳烃相比，达到吸附平衡时间较长，因此峰面积先增加后基本保持不变。因此，选择最佳萃取时间为30 min。

图3 萃取时间对PAHs萃取峰面积的影响

3.2.2 萃取温度的选择

萃取温度影响PAHs 在水相里面的分配，进而影响探针的萃取性能。学生自主选取20、30、40、50、60℃，考察不同萃取温度对PAHs 萃取性能的影响。通过比较不同温度下萃取色谱图的PAHs峰面积来选择最佳萃取温度。如图4 所示，随着萃取温度从20 ℃升高到60 ℃，低相对分子质量PAHs（如Nap、Any 和Ana）的峰面积逐渐减小，这是由于吸附过程是个放热过程，对于沸点低的小分子PAHs 应选择较低的萃取温度；Flu的峰面积随着萃取温度升高先增大后减小，而Phe的峰面积随着萃取温度升高先增大后基本保持不变，这是由于提高萃取温度会加速分析物向顶空的扩散，但大多数吸附过程是放热过程，高萃取温度会导致纤维上吸附的多环芳烃量被解吸；综合考虑后，选择萃取最佳温度为30 ℃。

图4 萃取温度对PAHs萃取峰面积的影响

3.2.3 盐浓度的选择

水溶液中盐的浓度影响PAHs在两相之间的分配系数，学生自主选取了NaCl 盐浓度分别为15%、20%、25%、27%和30%，考察水溶液中盐浓度对PAHs萃取性能的影响。根据色谱图峰面积大小，选择最佳盐浓度。如图5 所示，随着水溶液中盐浓度的质量百分数逐渐增加到27%时，萃取所得的PAHs 峰面积最大，当继续增加盐浓度时，水溶液中NaCl 有少量析出，故选择盐浓度为27%。

图5 盐浓度对PAHs萃取峰面积的影响

3.2.4 解吸时间的选择

解吸时间在一定程度上影响PAHs峰面积。短的解吸时间可能导致探针上PAHs 解吸不完全，因此学生自主选择了1、2、3、4 和5 min 5 个不同解吸时间，考察不同解析时间对PAHs萃取性能的影响。从图6 可以看出，解析时间对PAHs峰面积影响较小，表明吸附在探针表面的PAHs在高温下能快速从吸附剂上解析下来，考虑时间成本，故选择解析时间为1 min。

图6 解析时间对PAHs萃取峰面积的影响

3.3 方法的线性范围，检测限和精密度

为建立PAHs 的固相微萃取-气相色谱分析检测方法，每组学生将一系列不同浓度的PAHs 水溶液在最优的萃取和解吸条件下进行进样分析，考察线性范围、线性方程、线性相关系数的平方、检测限（LOD）（信噪比为3）、定量限（LOQ）（信噪比为10）及精密度（相对标准偏差RSD），并计算结果，其中一组学生数据见表1。从表中可以看出，基于铅笔芯为固相微萃取探针的SPME-GC-FID分析方法线性范围宽、检测灵敏度高、精密度好。

表1 多环芳烃浓度的线性范围、回归方程、相关系数、检测限、定量限和精密度

3.4 环境水样品的测定和加标回收率

利用本实验建立的方法，对湖水、雨水、自来水中的PAHs进行分析测定。每组学生自愿选择一种水样进行测定，进行3 个浓度的加标回收率实验，并计算回收率和相对标准偏差。表2 为其中一组学生检测湖水中PAHs 及加标回收率的结果，在湖水中未检测到PAHs，3 种不同浓度PAHs 加标回收率在66.76% ～114.17%，结果令人满意。图7 为湖水（A）和加标浓度为10 ng/mL（B）的湖水经SPME 的气相色谱图。这些研究结果表明本实验建立的SPME-GC 方法是一种准确检测痕量PAHs的分析方法。

表2 湖水样品中多环芳烃的分析结果

图7 湖水（A）和加标浓度为10 ng·mL -1的湖水（B）经SPME后的气相色谱图

4 结语

设计了基于廉价易得的铅笔芯为涂层材料的固相微萃取探针用于气相色谱检测环境水中的多环芳烃，是对原有仪器分析实验的改进，增加了固相微萃取相关内容，扩大了学生的知识面，让学生充分了解从材料制备、萃取分析和定量检测整个实验流程，使学生对仪器分析的实际应用有了更深刻的认识、了解和掌握。学生对分析条件进行优化，得到最优萃取条件和解吸条件，分别为萃取时间30 min、萃取温度30 ℃、盐浓度的质量百分数27%、解吸时间1 min。在最优条件下建立了基于铅笔芯涂层的SPME-GC 方法检测环境水体中的PAHs。该方法线性范围宽，检测灵敏度高，精密度高，加标回收率为66.76% ～114.17%。本实验设计结合了笔者相关的科研工作，将科研实践工作与仪器分析实验教学相结合，让学生认识到固相微萃取技术对分析检测的重要性，通过该实验让学生熟练掌握气相色谱仪的原理和操作，提高学生对数据结果的分析和处理能力，激发了学生的求知欲和创新意识，扩展学生的视野，让学生真切体会科研工作的重要性和趣味性，为后续职业发展和规划提供一定的引导作用。