唐 杨,邵高海

(重庆医科大学附属永川医院脊柱外科,重庆 402160)

幽门螺杆菌(HP)是一种革兰阴性螺旋状致病菌,可通过水解尿素产生二氧化碳和氨,从而中和胃酸,使HP长期定居于胃黏膜表面。长期的HP感染可引起慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌等疾病。HP有引起全身炎性反应的能力,与几种胃外表现有关,包括内分泌疾病,如自身免疫性甲状腺疾病、糖尿病、血脂异常和肥胖[1]。目前的流行病研究显示,全球一半以上人口感染了HP,其中超过4亿人有临床症状[2],而我国的HP感染率在41.5%～72.3%[3],HP及其相关疾病对社会及经济造成了巨大负担。骨质疏松症(OP)是以骨量减少、骨微结构破坏、骨强度下降、骨脆性增加、易发生骨折为特征的一种全身性、代谢性骨病[4]。OP可分为原发性和继发性。导致原发性OP的原因包括绝经后雌激素水平降低、增龄造成骨重建失衡等,继发性OP指由任何影响骨代谢的疾病和(或)药物及其他明确病因导致的骨质疏松。最新的一项多中心横断面研究估计,在我国40岁或以上成年人中,男性OP发生率为5.0%,女性为20.6%[5]。OP的临床表现为骨痛及骨质疏松性骨折,严重影响患者生活质量。HP感染和OP作为2种临床上常见疾病可能有着密切关系.有研究认为,HP感染可诱发炎症和免疫反应,如增加白细胞介素(IL)1和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平[6],从而可能引发骨吸收并调节骨再生。OP的危险因素有年龄、性别、体重指数、饮酒和吸烟等[7]。有研究指出,HP感染也是OP的危险因素[8-9],但这一结论存在争议[10-11]。因此,HP感染可能与OP密切相关,但二者关系尚不明确[12]。本研究主要通过生物信息学方法检索获得HP感染与OP的共同基因,构建疾病共同基因的蛋白互作(PPI)网络并筛选出关键靶点基因,对关键基因进行基因本体论(GO)功能和京东基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,阐述HP感染与OP的共同发病机制,理解二者在疾病过程中的相关性,为相关治疗药物的研发提供理论参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 在Disgenet、OMIM、TTD、GeneCards、Pharmgkb等基因数据库中查找引起OP和HP感染的疾病基因,去重整合后获得关键靶点。

1.2方法

1.2.1疾病靶点获取 在Disgenet数据库(https://www.disgenet.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、Pharmgkb数据库(https://www.pharmgkb.org/)中,以“helicobacter pylori”和“osteoporosis”为关键词检索HP感染及OP的疾病基因。在Disgenet、GeneCards数据库中筛选获得相关度较大的基因,将2组基因去重整合,通过在线网站Bioinformatics &Evolutionary Genomics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集获得韦恩图,得到交集的共同靶点基因。

1.2.2PPI网络分析与关键靶基因筛选 将获得的HP感染与OP共同靶点基因导入STRING在线数据库(https://cn.string-db.org/)构建PPI网络,物种设置为“Homo sapiens”得到PPI网络。使用Cytoscape_v3.9.1软件优化PPI可视化网络图,并以度值大于或等于26筛选出PPI网络中前10的关键靶点基因。

1.2.3基因富集分析 借助DAVID在线数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对HP感染与OP的共同靶点基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,筛选并列出前10的关键信号通路。使用在线网站微生信(https://www.bioinformatics.com.cn/)绘制富集结果气泡图。

2 结 果

2.1HP感染与OP基因收集情况 通过检索相关数据库初步获得HP感染相关基因2 572个,OP相关基因5 061个。在Disgenet数据库中设置Score≥0.3进行筛选,最终获得HP感染相关基因798个。在GeneCards数据库中设置Relevance score≥10,在Disgenet数据库中设置Score≥0.3进行筛选,最终获得OP相关基因493个,HP感染相关基因798个,通过取交集后获得69个HP感染与OP共同靶点基因。见图1。

图1 HP感染与OP共同靶点基因韦恩图

2.2PPI网络及关键靶点基因 通过STRING数据库构建HP感染与OP共同靶点基因的PPI网络,该网络图中包括66个节点和456条边。见图2。为确定HP感染与OP的关键靶点基因,利用Cytoscape_v3.9.1软件筛选出PPI网络中度值前10位的节点,包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、清蛋白(ALB)、CTNNB1、雌激素受体1(ESR1)、IL1B、IL6、瘦素(LEP)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)、MYC、TNF等。见图3。

图2 HP感染与OP共同靶点PPI网络图

图3 HP感染与OP共同核心靶点PPI网络图

2.3GO功能和KEGG通路富集分析 将HP感染与OP共同靶点基因导入DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析。GO功能主要富集在序列特异性DNA结合转录因子活性的正向调节、Ⅰ-κB激酶/核因子κB信号传导、IL-8合成的正向调节等方面。见表1、图4。KEGG通路包括人巨细胞病毒感染、沙门菌感染等信号通路。见表2、图5。

表2 KEGG通路富集分析(前10条)

图4 GO功能富集分析气泡图(前10条)

图5 KEGG通路富集分析气泡图(前10条)

3 讨 论

HP感染与OP作为2种常见的多发性疾病,其发病机制相对复杂,但在各自庞大的基因网络中也有部分重合的基因信息。本研究应用生物信息学寻找庞大基因交叉部分,通过对核心靶点进行GO功能富集分析发现,HP感染与OP之间相互影响主要涉及以下生物过程:细胞凋亡过程的负向调节、神经胶质细胞增殖的正向调节、DNA模板化转录的正向调节、胰岛素分泌调节、NO生物合成过程的正向调节等。同时,通过KEGG通路富集分析发现,HP感染与OP之间可涉及多条共同信号通路,主要涉及炎症因子、感染、肿瘤代谢等方面。通过映射获得OP与HP感染的核心交集靶点,AKT1、ALB、CTNNB1、ESR1、IL1B、IL6、LEP、MMP9、MYC、TNF等为影响二者的重要靶点。这些核心交集靶点是可以通过不同的作用机制来影响人体的HP感染和OP。有研究表明,可通过抑制AKT/叉头框蛋白O1信号通路抑制OP,从而改善OP[13]。长链非编码RNA DANCR和miR-320a通过CTNNB1抑制调节OP成骨分化过程中的Wnt/β-连环蛋白信号通路[14],从而影响OP。此外,ESR1包含许多多态性(Xbal和PvuⅡ),这可能在OP中起重要作用,其被认为是骨折的易感基因[15]。部分候选基因如ESR1(骨中雌激素作用的主要介质)和骨密度与OP有关[16-18]。miR-874-3p通过下调LEP的表达促进人骨髓间充质干细胞的增殖和分化,从而抑制OP[19]。MMP9的过表达减弱破骨细胞形成,并抑制促炎细胞因子分泌[20]。MYC通过调节miR-320a/磷酸酶与张力蛋白同源物通路增强核因子κB受体活化因子配体诱导的破骨细胞的形成[21]。这一系列核心靶点可通过不同的作用机制影响HP感染及OP的骨形成或骨吸收的病理生理过程。

在所有核心靶点中,TNF、IL1B和IL6是HP感染和OP相互作用的关键节点。HP感染可诱发与消化道外疾病相关的个体炎症和免疫反应[22]。HP感染人体后可释放细胞因子如TNF-α、IL1和IL6,这些细胞因子可调节骨骼的吸收和转化,促进破骨细胞的形成,进而引起局部或全身性OP[6]。HUANG等[23]的一项研究驳斥了全身炎症与OP有关的观点,其认为HP感染除了引起炎症外还可能导致OP。如慢性HP感染可能导致胃黏膜萎缩,减少胃酸分泌,进而抑制钙的吸收,从而有可能对骨量产生不利影响[24]。同样,长期使用质子泵抑制剂治疗或预防胃十二指肠黏膜损伤与骨密度降低和骨折相关[25]。此外,对于男性患者而言,OP的另一个潜在机制可能是雌激素水平降低,这反过来又可能增加CagA+HP菌株的骨吸收[26]。因此,HP的感染主要通过炎症因子及感染从而影响患者OP。

通过核心靶点富集分析可以发现,诸多靶点通过调控多条通路发挥对HP感染及OP的作用。这些信号通路多为炎症感染有关的通路。乙型肝炎病毒相关性肝硬化是OP的危险因素,骨吸收增强是严重肝硬化患者OP风险增加的原因[27]。而肝硬化多为乙型肝炎感染所致。在对77 515例患者3年的随访中发现,HP感染女性患者OP发生率高于未感染女性患者[28]。最近的研究表明,HP感染不仅与胃肠道疾病有关,还与缺铁性贫血、免疫性血小板减少性紫癜、维生素B12缺乏、非酒精性脂肪性肝病、冠状动脉疾病、代谢综合征和糖尿病等有关[29-30].因此,HP感染可导致胃肠道外的全身各种炎症。HP感染可导致全身产生TNF因子,TNF超家族成员11调节多种生理或病理功能,包括破骨细胞分化和OP[31],TNF-α可诱导独立于核因子-κB受体活化因子及其配体系统的破骨细胞分化[32],从而导致OP。肝脏炎症和骨质流失病理生理学的潜在关键因素之一是TNF-α。几位独立研究人员报道了非酒精性脂肪性肝病患者TNF-α水平会增加[33]。HP感染多通过消化系统及全身的炎症感染影响患者骨代谢变化,从而导致OP。这为合并有HP感染的OP患者的治疗提供一个指导方向。在严重OP患者中可进行HP感染的筛查,若合并HP感染,抗骨质疏松治疗的同时可予以抗HP治疗,这样可能比单纯的抗OP治疗具有更好的效果。目前关于此种治疗方案的临床报道较少见,值得进一步探索。本研究通过对多个基因数据库进行基因信息整合发现了HP感染和OP的核心交集靶点,同时发现了炎性反应在2种疾病中扮演的角色。HP感染后可导致一系列炎性反应,而炎性反应可产生多种炎症因子(如TNF、IL1和IL6等),该炎症作用于多种信号通路,影响骨形成和骨吸收,从而导致OP。因此,对于OP患者或OP合并HP感染患者,积极地治疗与控制HP导致的感染及炎症,可能对控制OP有十分重要的作用。

综上所述,HP感染多通过导致炎性反应产生炎症因子,从而作用于影响骨吸收及骨形成的信号通路,最终导致或加重OP。本研究初步探讨了HP感染与OP之间存在的相同致病基因和密切相关的信号调节途径,为探索HP感染与OP的治疗靶点提供了一定理论参考。本研究存在一定局限性,未对上述疾病靶点基因和信号通路进行验证,需要在今后进一步临床及基础研究中明确其具体机制。