严祖浩，李晓薇，夏 曦

（中国农业大学 动物医学院，北京 100193）

牛奶已经成为我国消费者膳食的重要组成部分，其主要营养成分包括蛋白质（3.0%～3.9%）、乳糖（4.4%～5.6%）、脂肪（3.3%～5.4%）和矿物质（0.7%～0.8%）［1］。此外，牛奶还是多种微量营养元素的重要来源，包括钙、磷、镁、锌、碘、钾、维生素 A、维生素D、维生素 B12，这些微量元素对儿童和青少年的生长发育，以及维持成人身体健康均具有极大帮助［2-3］。由于养殖场对抗菌药物的不合理和不规范使用，导致牛奶中抗菌药物残留超标并严重危害人类公共安全［4］。β-受体激动剂是苯乙醇胺类化合物，在动物饲养中能够改变养分的代谢途径，促进动物肌肉生长及骨骼肌蛋白质的合成，加速脂肪转化和分解，提高牲畜瘦肉率［5］。但畜产品中的激动剂残留可能会造成人体健康风险，哮喘或心血管疾病患者摄入后还可能引起头晕、心悸、血压升高、心率加快等心血管系统的中毒反应，甚至导致死亡［6］。为了确保消费者的食品安全，不同国家对牛奶中抗菌药物的最大残留限量（MRLs）做出了规定，我国在GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》中规定［7］，除磺胺二甲嘧啶（25µg·kg-1）外的磺胺类药物的MRL 均为100 µg·kg-1；土霉素、金霉素、四环素的MRL 均为100 µg·kg-1。世界上大多数国家和地区，如欧盟、日本等已禁止β-受体激动剂类药物用于食品动物，我国农业农村部第250号公告规定禁止使用β-受体激动剂类药物作为兽药和饲料添加剂［8］。

目前，牛奶中多种兽药残留的仪器检测方法国内外均有报道，包括毛细管电泳法［9-10］、高效液相色谱法［11-12］、液相色谱-串联质谱法［13-14］、超高效液相色谱-飞行时间质谱法［15-16］等。样品前处理是检测牛奶中兽药残留的关键步骤，一般包括液液萃取［17］、常规固相萃取［18-19］、分散固相萃取［13，20-21］等。本实验旨在建立基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF MS）的牛奶中多种兽药残留的筛查方法，为牛奶中的兽药残留检测提供参考。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；质谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司），甲醇、正己烷（质谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司），甲酸（质谱纯，奇睿化学科技有限公司），实验用水由Millipore超纯水仪制备。

以下为标准品：

1种喹诺酮类药物内标：恩诺沙星-D5。

30 种β-受体激动剂类药物：班布特罗、巴美生、溴布特罗、溴代克仑特罗、卡布特罗、西布特罗、克仑塞罗、克仑西罗、盐酸克仑西罗、异克仑潘特、盐酸克仑特罗、克仑丙罗、氯丙那林、非诺特罗、福莫特洛、羟甲基克仑特罗、盐酸苯氧丙酚胺、拉贝洛尔、苯乙醇胺A、利妥特灵、索他洛尔、特布他林、妥布特罗、齐帕特罗、马喷特罗、马布台诺、吡布特罗、可尔特罗、奥西那林、沙美特罗。

15 种β-受体激动剂类药物内标：溴布特罗-D9、卡布特罗-D9、西布特罗-D9、盐酸克仑特罗-D5、克仑丙罗-D7、氯丙那林-D7、盐酸氧丙酚胺-13C6、沙美特罗-D（3Salmeterol-D3）、齐帕特罗-D7、苯乙醇胺A-D3、特布他林-D9、妥布特罗-D9、马布台诺-D9、吡布特罗-D9、奥西那林-D7。

4种四环素类药物：四环素、金霉素、土霉素、多西环素。

β-受体激动剂类药物及内标由德国BVL 实验室提供，磺胺类、四环素类和喹诺酮类药物由天津阿尔塔公司提供。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪（ACQUITY UPLC I-Class PLUS，沃特世公司），四极杆-飞行时间质谱仪（X500 B，美国SCIEX公司），高速冷冻离心机（Eppendorf公司），TARGIN VX-Ⅲ多管涡旋振荡器（北京踏锦科技有限公司），N-EVAP-112氮吹仪（美国Organomation公司）。

1.3 溶液配制

标准溶液制备：分别称取10 mg 标准品于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成质量浓度为1 mg·mL-1的单标储备液，置于-20 ℃冰箱中避光保存。

混合标准工作液：根据实际需要，将单标储备液混合配制成不同质量浓度的混合标准工作液，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.4 仪器方法

1.4.1 色谱条件色谱柱：ACQUITY BEH C18（2.1 mm × 50 mm，1.7 µm）；柱温40 ℃；进样体积2µL；流速：0.3 mL/min；流动相A 相为0.1%甲酸溶液，B 相为含0.1%甲酸的甲醇-乙腈（2∶8，体积比，下同）溶液，梯度洗脱程序：0～2 min，95%～85% A；2～5 min，85%～60% A；5～7 min，60%～5% A；7～8.5 min，5% A；8.5～8.6 min，5%～95% A；8.6～10 min，95% A。

1.4.2 质谱条件电喷雾正离子模式（ESI+）；雾化气：344 737.85 Pa（50 psi）；加热气：344 737.85 Pa（50 psi）；气帘气：241 316.50 Pa（35 psi）；加热气温度：500 ℃；碰撞气：48 263.30 Pa（7 psi）；电喷雾电压：5 500 V；TOF MS 一级母离子扫描参数：扫描范围100～10 000 Da；去簇电压：80 V；TOF MS/MS 子离子扫描参数：扫描范围：50～1 000 Da；去簇电压：80 V；碰撞能量：35 V；碰撞电压的变化步阶：15 V。

使用SCIEX公司提供的正模式调谐溶液，对仪器质量轴进行校准，参比离子为m/z132.904 90、m/z266.159 81、m/z354.212 24、m/z442.264 67、m/z609.280 66、m/z829.539 33、m/z961.436 96、m/z1 446.732 24 和m/z1 561.603 32，子离子参比离子为m/z58.065 1、m/z86.096 4、m/z235.135 6、m/z174.091 3、m/z365.186 0、m/z448.196 6、m/z724.496 7、m/z607.417 8、m/z512.344 3、m/z811.528 8。

1.5 样品前处理

称取1.00 g 牛奶，添加内标后静置10 min，加入0.5%甲酸乙腈5 mL，涡旋振荡3 min，4 ℃下10 000 r/min 离心5 min。取上清液，加入10 mL 乙腈饱和的正己烷，手摇20 次，4 ℃下10 000 r/min 离心5 min，弃上清液。下层提取液40 ℃氮气吹干，加入0.1%甲酸甲醇300 µL，涡旋1 min，加入0.1%甲酸溶液700 µL，涡旋1 min，再加入5 mL 乙腈饱和的正己烷，手摇20 次，4 ℃下10 000 r/min 离心5 min，弃上清液。下层溶液于4 ℃下14 000 r/min 离心20 min，过0.22 µm滤膜，上机检测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

本实验对比了不同色谱柱和流动相对药物的分离能力，考察了不同色谱柱（COPTECS UPLC Shield RP18（2.1 mm × 100 mm，1.6 µm）、ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm × 50 mm，1.7 µm））和流动相（0.1%甲酸-乙腈和0.1%甲酸-甲醇/乙腈（2∶8））对69种兽药分离、离子化效率和峰形的影响。结果表明：Shield RP18 对磺胺对甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪的分离度差，而BEH C18对上述同分异构体的分离度良好（图1）；与0.1%甲酸-乙腈相比，有机相中增加甲醇可以获得更好的分离效果［22］，且含0.1%甲酸的甲醇-乙腈（2∶8）作为有机相可使目标化合物的峰形更加对称。所以最终使用BEH C18（2.1 mm ×50 mm，1.7 µm）色谱柱，0.1%甲酸为水相，含0.1%甲酸的甲醇-乙腈（2∶8）为有机相进行梯度洗脱，以实现目标物化合物的有效分离。69种兽药的提取离子色谱图见图2。

图1 不同色谱柱的分离效果Fig.1 Separation effect of different columns

图2 69种兽药基质标准溶液的总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of the matrix standard solution of 69 veterinary drugs

2.2 质谱条件的优化

高分辨质谱的数据采集模式可分为数据依赖采集模式（DDA）和数据非依赖采集模式（DIA）两种，其中DDA 是根据提前设定的条件，如离子强度、信噪比等对母离子进行筛选，获得二级质谱信息，所得到的二级谱图无干扰离子，但在非靶向筛查时会出现分析重复性较差，二级信息覆盖率低等问题；DIA 则不预先对母离子进行选择，在低能量时获得一级质谱图，高能量时获得二级碎片，理论上能够全面地获得所有离子的碎片信息，但所获的二级谱图存在其他母离子碎片的干扰，且数据解析时间更长［23］。本实验对比了DDA和DIA两种模式在69种兽药筛查中的差异，发现二者在目标化合物定量方面的差异不显著；DDA 模式的二级质谱干扰离子较少，可获得含较高质量碎片信息的二级图谱，以磺胺噻唑为例，其DDA 和DIA 模式下的二级质谱图见图3。将所有目标化合物通过超高效液相色谱仪进行色谱分离，用Q-TOF MS 进行质谱信息采集，并在m/z100～1 000 范围内进行一级质谱全扫描，采用DDA模式进行二级质谱扫描分析，收集69种目标化合物的保留时间、母离子和子离子精确分子质量信息，结果见表1。

表1 69种兽药的质谱参数Table 1 Mass spectrometry parameters of 69 veterinary drugs

图3 磺胺噻唑的二级质谱图Fig.3 MS/MS spectra of sulfathiazole

（续表1）

2.3 前处理条件的优化

牛奶中含有丰富的蛋白质，可能会干扰目标化合物的检测以及导致色谱柱或仪器管路堵塞等问题，因此需要进行蛋白沉淀。由于对不同种类药物同时提取存在一定的困难，文献显示，对于本文所选的69 种目标物，酸性提取液的效果优于中性和碱性提取液［22，24］。本实验考察了0.1%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈和1%甲酸乙腈3 种不同提取液对目标化合物的提取效果，结果表明，随着甲酸体积分数的增加，四环素类和磺胺类药物的回收率增加，喹诺酮类和β-受体激动剂类药物的回收率无明显变化，但1%甲酸乙腈提取部分磺胺类药物时的回收率偏高，与文献［25］类似。实验最终选择0.5%甲酸乙腈作为提取试剂。

牛奶基质复杂，除富含蛋白质外，还有乳脂、乳糖、碳水化合物和少量矿物质等杂质，因此有必要对样品进行净化，减少基质的影响。常见的牛奶净化方法有固相萃取法、低温冷冻除脂法［24］和正己烷除脂法，其中固相萃取法常使用HLB 和Prime HLB 等萃取柱。本实验以乙腈饱和的正己烷进行除脂净化，通过提取后和复溶后两次除脂，可有效去除牛奶中大部分的基质干扰，减少了过柱等繁琐操作步骤，更加经济快速，有利于实际样品的高通量检测分析。

2.4 基质匹配标准曲线及灵敏度

取空白牛奶样品，按“1.5”进行样品前处理，量取混合标准工作液适量，用空白样品提取液溶解稀释，配制成系列基质匹配标准工作溶液，对其中的目标化合物进行测定。对于采用外标法的化合物，以化合物的离子峰面积为纵坐标（Y），标准溶液浓度为横坐标（X），绘制标准曲线；对于使用内标法的化合物（13 种喹诺酮类药物、溴布特罗、西布特罗、异克仑潘特、盐酸克仑特罗、克仑丙罗、氯丙那林、福莫特洛、盐酸苯氧丙酚胺、苯乙醇胺A、索他洛尔、特布他林、妥布特罗、齐帕特罗、马布台诺、吡布特罗、奥西那林、沙美特罗），以化合物的离子峰面积和对应内标峰面积的比值为纵坐标（Y），标准溶液浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。69种目标化合物在10～200 µg·kg-1范围内呈现良好的线性关系，相关系数（r2）均不低于0.99（表2）。以各目标化合物信噪比为10（S/N=10）时对应的浓度作为定量下限（LOQ），69种目标物在牛奶中的LOQ为10 µg·kg-1，具有较好的灵敏度。

表2 69种兽药的线性范围、相关系数、定量下限及最高残留限量Table 2 Linear ranges，correlation coefficients，limits of quantification and maximum residue limits for 69 veterinary drugs

（续表2）

2.5 回收率与相对标准偏差

对牛奶样品中的69种兽药进行10、50、100 µg·kg-13个水平的加标，每个加标水平平行测定6次，计算批内平均回收率和批内相对标准偏差（RSD）；连续测定3 天，计算批间平均回收率和批间RSD。外标法定量药物的批内平均回收率为59.0%～120%，批内RSD不大于12%，批间平均回收率为62.0%～119%，批间RSD 不大于11%；内标法定量药物的批内平均回收率为75.4%～117%，批内RSD 不大于12%，批间平均回收率为79.3%～107%，批间RSD 不大于13%，结果见表3。加标实验结果表明该方法具有良好的回收率和精密度，满足多残留筛查分析要求。

表3 牛奶中69种兽药的加标回收率和相对标准偏差Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of 69 veterinary drugs in milk

2.6 实际样品分析

采用所建立的方法对市场采集的34种不同牛奶样品进行筛查。首先以一级全扫描质谱数据的母离子精确质量数和保留时间进行比对，通过二级质谱碎片离子对检出的疑似阳性样品进行确证分析。结果在1 份样品中检出恩诺沙星，含量为18.3 µg·kg-1；另有一份样品检出四环素，含量为32.6 µg·kg-1（图4）。两种药物的检出含量均未超出其最大残留限量（100 µg·kg-1）。

3 结 论

本研究建立了超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱测定牛奶中β-受体激动剂类、磺胺类、喹诺酮类、四环素类4 类共69 种限用和禁用兽药的筛查方法。与传统兽药残留检测方法相比，本方法优化了样品前处理步骤，可同时快速筛查牛奶中69 种兽药的残留量，具有操作简单、检测效率高等优点。所建立的方法在快速筛查牛奶中兽药残留方面有明显优势，可一次性分析多类不同目标化合物，为牛奶中的兽药残留监管提供了有力的技术支撑。