肖宜容,陈怡梦,庞艳华,陈 新,2,张雨梅,2*

(1.扬州大学兽医学院,江苏扬州 225009;2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州 225009)

脱氢乙酸钠(sodium dehydroacetate,DHA-S)又称脱氢醋酸钠,可以有效抑制酵母菌、霉菌、细菌和大肠埃希氏菌等微生物的生长[1,2],常被用作食品和饲料的防霉、防腐添加剂。有关DHA-S的毒性研究表明, 62.0 mg/kg和 124.0 mg/kg DHA-S经口服连续给予 90 d时,对大鼠有轻微的全身毒性,表现为体重和食物利用率显著降低,促甲状腺激素水平显著升高等[3]。150 mg/kg、200 mg/kg及较高剂量DHA-S可引起鼠出血性倾向和凝血功能异常,并在多个组织器官中可以观察到严重出血[4,5]。

华法林为临床常用的维生素K拮抗剂类抗凝药,广泛用于预防和治疗血管栓塞性疾病[6]。华法林为含香豆素类结构的衍生物,在大鼠中具有明确的抗凝血作用[7]。华法林可通过竞争性抑制维生素K环氧化物还原酶(VKOR)的活性,进而抑制VK环氧化物(VKO)还原成VK并还原成氢醌型维生素K(KH2),妨碍VK的循环再利用,干扰VK依赖性凝血因子II、VII、IX、X的活化,从而产生抗凝作用[8]。目前已知VKOR是VK循环中的限速酶,也是华法林抗凝作用的作用位点。VKOR在肝脏组织中起主要的活性作用,其亚型维生素K环氧化物还原酶亚型Ⅰ(VKORC1)在肝组织中还原了90% 以上的VKO,是VKOR的主要活性成分[9]。DHA-S具有与华法林相似的香豆素结构[10],推测长期给予DHA-S 后可能降低大鼠体内VKORC1的表达从而存在出血性倾向。

研究发现灌胃 200 mg/kg脱氢乙酸钠后大鼠凝血指标与正常组有显著性差异[11],但有关DHA-S凝血障碍的机制并不清楚。本文通过给予大鼠 200 mg/kg脱氢乙酸钠后测定大鼠凝血指标、肝脏中DHA-S含量和VKORC1的表达量,来研究DHA-S在肝脏中的组织浓度、肝脏中VKORC1水平对大鼠凝血功能的影响间的关系,可为DHA-S在畜禽中的安全应用提供参考,为DHA-S致大鼠出血的机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Wistar大鼠,200 g±20 g,雌雄各半,购自扬州大学比较医学中心,动物生产许可证号SCXK(苏)2017-0004。动物使用许可证号为SYXK(苏)2017-0044。自由饮水和采食,饮水为符合城市饮用水标准《GB 5749-2006生活饮用水卫生标准》的自来水。大鼠试验前在试验环境中适应3 d,灌胃前禁食12 h,不限制饮水。

1.1.2 主要试剂 DHA-S,纯度≥98%(批号 20190818),江苏天成动物保护公司产品;凝血酶原(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂盒(鞣花酸型),南京建成生物科技有限公司产品;荧光定量试剂盒BeyoFastTMProbe qPCR Mix(2x)(批号:D7271),碧云天生物技术有限公司产品;RNA提取试剂盒Fast®Cell/Tissue Toal Isolation Kit V2(批号RC112)、反转录试剂盒HiScript®Ⅲ1st strand cDNA Synthesis Lit(批号;R312-01),南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品;兔抗大鼠Vkorc1多克隆抗体(批号GTX47837),美国GENE TEX公司产品;RT-qPCR引物、BCA蛋白浓度测定试剂盒,上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 TRON M4凝血仪,德国TECO Gmbh公司产品;Agilent 1200高效液相色谱仪,四元泵,配VWD检测器;色谱柱:Agilent C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);进样针(100 μL),安捷伦科技有限公司产品;水平电泳仪(批号:DYY-6D)、水平电泳槽(批号:DYCP-31DN),北京六一生物科技有限公司产品;Mini PROTEAN®Tetra Cell垂直电泳系统(批号1658001)(含电泳槽、转印槽)、凝胶成像系统ChemiDocTmXRS+、快速光学96反应孔密封膜,美国Bio-Rad公司产品;实时荧光定量PCR仪,7500 Fast,美国Applied Biosystems公司产品;酶标仪,美国Bio-Tek公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DHA-S的给予及采样 Wistar大鼠60只,连续11 d灌胃给予 200 mg/kg的DHA-S,空白对照组(n=6)给予等量生理盐水。分别于DHA-S给予后3 d、5 d、7 d、9 d、11 d时安乐死处死大鼠。各时间点取6只大鼠,雌、雄各半,眼眶后静脉丛采集静脉血,按9∶1加入枸橼酸钠后,3 000 r/min离心15 min后收集血浆,按PT和APTT检测试剂盒说明书,在2 h内用TRON M4凝血仪,进行凝血指标PT和APTT的测定;并分别取其肝脏,于-20℃保存,用HPLC法检测其中DHA-S含量。

1.2.2 HPLC法测定脱氢乙酸钠含量 HPLC法测定肝脏中DHA-S含量的方法,参照邓迎春的方法[12]。肝脏样品前处理方法为:取5 g肝脏组织准确称量后与4.0 g无水硫酸镁、16 mL乙腈于50 mL离心管中,11 000 r/min匀浆1～2 min至无明显可见组织块,加入200 μL冰醋酸,涡旋混匀3 min,超声振荡提取15 min,4 000 r/min离心15 min,将上清液转移至100 mL鸡心瓶。残渣中加入16 mL乙腈,涡旋混匀3 min,超声波振荡15 min重复提取一次,合并上清液。加2.5 mL正丙醇,45℃旋转蒸发至近干。残渣加1.0 mL流动相涡旋复溶后,转移至1.5 mL离心管中,12 000 r/min离心15 min,上清过0.22 μm有机系滤膜,供HPLC检测用。

大鼠肝脏DHA-S的HPLC测定条件:Agilent C18色谱柱(4.6×250 mm,5 μm);流动相为甲醇0.02 mol/L乙酸铵(30∶70,v/v);检测波长293 nm。外标标准曲线法计算样品中DHA-S的含量。

1.2.3 qRT-PCR法检测Vkorc1基因的表达 根据GenBank中大鼠Vkorc1、β-actin基因序列,应用Primer premier5软件设计qRT-PCR引物,引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下所示:

Vkorc1:F-5′GGACGTTGGGCCTCTATCCT3′

R-5′CAACATCAGGCCCGCATTGA3′

β-actin:F-5′AGATCAAGATCATTGCTCCTCCTG3′

R-5′CGCAGCTCAGTAACAGTCCG3′

提取总RNA后用测定OD260/OD280的比值,检测制备的总RNA纯度。反转录合成cDNA后进行RT-qPCR反应。

反转录反应体系终体积为20 μL:SYBR Premix ExTaqⅡ(2×)(Tli RNaseH Plus),Bulk 10 μL; 10 μM的上下游引物各0.8 μL;ROX Reference Dye(50×)0.08 μL;DNA 模板(<100 ng)2 μL;ddH2O 6.32 μL。

PCR反应条件如下:95℃ 30 s;95℃ 3 s,60℃ 30 s,共40个循环。重复3次,用无菌水代替cDNA模板作为阴性对照排除基因组DNA的污染。

1.2.4 Western blot检测Vkorc1蛋白的表达 将肝组织研磨后提取蛋白并测定蛋白含量,且在沸水浴10 min使蛋白变性。配制SDS-PAGE凝胶;加入待测样品后进行电泳,电泳结束后转膜;封闭2 h;加入1 000倍稀释的Vkorc1一抗,4℃孵育过夜(12～16 h);孵二抗(按1∶2 000稀释),继续室温孵育2 h后,加ECL显影、拍照。

2 结果与分析

2.1 DHA-S对大鼠凝血指标PT和APTT的影响

200 mg/kg DHA-S对大鼠凝血酶原时间PT和APTT的影响见图1。随着灌胃给予200 mg/kg DHA-S时间的延长,雄、雌鼠的PT值均明显延长。雌鼠连续给予DHA-S后所有时间点的PT值均显著升高(P<0.05),雄鼠处理 5 d、7 d、9 d、11 d后PT值均显著增加(P<0.01)。 DHA-S处理7 d和9 d时,雌鼠的PT值均极显著高于雄鼠。7 d和9 d时雄鼠PT时间较正常组分别延长5.73 s、8.02 s,雌鼠的PT时间较正常组分别延长14.35 s、15.87 s,雌鼠PT延长值分别约为雄鼠的2.5倍和1.9倍;DHA-S处理后,雄鼠PT值最高约为对照组的1.48倍;雌鼠PT值最高约为对照组的2.01倍。

A.200 mg/kg DHA-S对大鼠PT的影响; B.200 mg/kg DHA-S对大鼠APTT的影响A.Effect of 200 mg/kg DHA-S on rat PT; B Effect of 200 mg/kg DHA-S on APTT in ratsn=6;与同一天数对照组同性别间比较,*P<0.05,**P<0.01n=6;Compared with the control group on the same day,*P<0.05,**P<0.011.给药3 d;2.给药5 d;3.给药7 d;4.给药9 d;5.给药11 d;1.Dose 3 d;2.Dose 5 d;3.Dose 7 d;4.Dose 9 d;5.Dose 11 d图1 200 mg/kg DHA-S对大鼠凝血指标的影响Fig.1 Effect of 200 mg/kg DHA-S on coagulation indexes in rats

随着处理时间的延长APTT值呈增加的趋势。其中雄鼠经DHA-S处理5 d、7 d后,APTT值显著升高(P<0.05),9 d、11 d极显著升高(P<0.01); 9 d、11 d时APTT值约为正常对照组的1.37倍和1.19倍。雌鼠处理 3 d、5 d后,APTT值显著升高(P<0.05),7 d、9 d后APTT值极显著升高(P<0.01);7 d、9 d时的APTT值分别为正常对照组的1.47倍和1.71倍。在7 d和9 d时,雌鼠APTT延长值显著高于雄鼠,分别是雄鼠APTT延长值的1.50倍、1.17倍。

表明DHA-S较长时间给予后,雄或雌大鼠的凝血功能均被抑制,且对雌鼠的抑制大于雄鼠, DHA-S对大鼠凝血功能的抑制存在明显的性别差异。

2.2 DHA-S对Vkorc1基因mRNA水平的影响

RT-qPCR法对雌、雄鼠肝脏中Vkorc1 mRNA水平的比较结果,如图2所示。雄、雌大鼠肝脏组织内Vkorc1 mRNA表达水平随着处理时间的延长逐渐降低。 DHA-S处理3～9 d后,雌鼠肝脏中Vkorc1均显著降低(P<0.05),在处理后7 d、9 d,Vkorc1 mRNA均显著低于雄鼠,下降了50%以上。雄鼠在连续处理5 d后,肝脏中Vkorc1 mRNA表达水平显著降低;至处理11 d时极显著降低(P<0.01),下降约45%。DHA-S对雄鼠Vkorc1 mRNA表达水平的抑制少于雌鼠。而肝脏中Vkorc1水平或活性与VK依赖性凝血因子的活化(凝血功能)呈正相关。

*P<0.05,**P<0.01,DHA-S与正常对照组比较。#P<0.05,同时间与雄鼠比较*P<0.05,**P<0.01,compared with the normal control group# P<0.05,comparison of male rats at the same timeM.正常对照组;1.给药3 d;2.给药5 d;3.给药7 d;4.给药9 d;5.给药11 dM.Control;1.Dose 3 d;2.Dose 5 d;3.Dose 7 d;4.Dose 9 d;5.Dose 11 d图2 RT-qPCR检测DHA-S处理组大鼠肝脏Vkorc1基因表达量Fig.2 Detection of Vkorc1 gene expression in liver of rats treated with DHA-S by RT-qPCR

2.3 DHA-S对Vkorc1蛋白水平的影响

以 200 mg/kg的DHA-S剂量灌胃给予大鼠后,其肝脏中的Vkorc1蛋白表达情况如图3和图4所示。DHA-S给予3 d后,雄鼠肝脏中Vkorc1蛋白的表达量较正常对照有显著下降(P<0.05),在连续灌胃给予 DHA-S 5 d后,肝脏中的Vkorc1蛋白表达量与正常对照组相比有极显著的降低(P<0.01)。 连续灌胃5 d后,雌鼠肝脏中的Vkorc1蛋白表达较正常组显著降低(P<0.05),在连续灌胃DHA-S 9 d时,肝脏中Vkorc1蛋白表达量较正常对照组极显著降低(P<0.01),雌鼠9 d处理组肝脏中Vkorc1蛋白的表达量不及正常对照组的一半。表明脱氢乙酸钠抑制雌鼠凝血功能可能与抑制Vkorc1蛋白表达相关。

A.雄鼠肝脏中WB条带;B.雌鼠肝脏中WB条带A.WB bands in male rat liver; B.WB band in female rat liverM.正常对照组;1.给药3 d;2.给药5 d;3.给药7 d;4.给药9 d;5.给药11 dM.Control;1.Dose 3 d;2.Dose 5 d;3:Dose 7 d;4:Dose 9 d;5:Dose 11 d图3 雌、雄鼠肝脏中Vkorc1蛋白条带Fig.3 Vkorc1 protein bands in the liver of female and male rats

*P<0.05,**P<0.01,与正常对照组相比*P<0.05,**P<0.01,compared with the normal control groupM.正常对照组;1.给药3 d;2.给药5 d;3.给药7 d;4.给药9 d;5.给药11 dM.Control;1.Dose 3 d;2.Dose 5 d;3.Dose 7 d;4.Dose 9 d;5.Dose 11 d图4 雌雄鼠肝脏中Vkorc1蛋白条带灰度值分析统计图Fig.4 Statistical diagram of gray value analysis of Vkorc1 protein bands in the liver of male and female rats

2.4 大鼠肝脏中DHA-S的测定

2.4.1 测定肝脏中DHA-S HPLC法测定肝脏中DHA-S,本方法的LOD为0.08 mg/kg,LOQ为0.2 mg/kg。0.2 mg/kg DHA-S空白添加样品的平均添加回收率在81.94%～88.21%范围内,日内变异系数为2.39%～5.42%,日间变异系数为2.74%～6.09%。

2.4.2 DHA-S在大鼠肝脏中浓度 200 mg/kg连续灌胃大鼠后,给药11天后雄鼠肝脏内DHA-S含量达到最高为(28.52±0.84)mg/kg;给药3天后雌鼠肝脏内DHA-S含量达到最高为(37.57±4.18)mg/kg,分析雄、雌鼠肝脏内DHA-S含量见得知在同一时间点雄鼠肝脏中DHA-S浓度明显低于雌鼠,差异具显著性(P<0.01)。

2.5 肝脏中VKORC1及DHA-S浓度与凝血指标的相关性分析结果

2.5.1 DHA-S肝脏浓度与PT、APTT间的相关性分析结果 DHA-S处理后,PT、APTT与DHA-S肝脏浓度间的相关性分析发现雄鼠肝脏中DHA-S含量与其PT、APTT值相关性较低,雌鼠肝脏中DHA-S含量与其PT、APTT值相关系数高于0.795,具有较好的相关性。

2.5.2 肝脏中VKORC1与PT、APTT间的相关性分析结果 大鼠组织中Vkorc1与PT、APTT间的相关性分析见发现雄鼠肝脏中Vkorc1的表达量与其PT、APTT间相关系数在0.74～0.89,雌鼠肝脏中Vkorc1表达量与其PT、APTT间相关系数在0.85～0.89之间,均呈显著相关(P<0.05)。

3 讨论

凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)是常用检测抗凝活性的指标,PT常用于检测外源性凝血途径,是凝血酶原转化为凝血酶的时间,当PT延长时,常反应凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ 及纤维蛋白原缺乏,APTT是外源性凝血指标,APTT延长常见于内源性凝血因子(因子Ⅺ、Ⅷ、Ⅸ)缺乏或一些免疫学疾病和抗凝药物的使用[13-14]。长期给药后与正常对照组相比,随着给药时间的延长,雌雄大鼠的APTT、PT值都显著增加;且雌雄鼠处理组间存在显著性差异,雌雄大鼠肝脏中DHA-S的含量与PT、APTT的相关性较好,提示DHA-S会抑制大鼠的凝血功能,其抗凝作用与给药时间呈正相关,且雌性大鼠比雄性大鼠更加敏感。

DHA-S与华法林具有相似的双香豆素结构,华法林通过抑制VKOR的活性来发挥抗凝血作用,其亚型Vkorc1被鉴定为香豆素药物的分子靶点,Vkorc1还是维生素K循环中的关键酶[15-16]。本试验测定了DHA-S不同天数处理组Vkorc1蛋白和mRNA表达水平的测定,结果显示随着DHA-S处理天数的增加,不同性别大鼠200 mg/kg DHA-S处理组肝脏内Vkorc1mRNA及蛋白表达水平均呈下降趋势,雌性大鼠Vkorc1的表达低于雄性大鼠,且雌雄大鼠肝脏中Vkorc1的表达量与PT、APTT的相关性都较好。表明DHA-S通过抑制大鼠肝脏中Vkorc1 mRNA及蛋白的表达,继而导致大鼠出血,与华法林的诱导出血的作用机制相似[17],同时DHA-S对Vkorc1表达的抑制作用存在性别差异,对雌性大鼠抑制作用更强。

由于脱氢乙酸钠的防霉抗菌特性,随着其作为饲料添加剂的广泛应用,其不良反应的相关报道越来越多[18-19],但关于凝血障碍的报道有限。本试验通过连续给与大鼠200 mg/kg的DHA-S 11 d,发现雌性大鼠给药9 d后出现死亡,雄性大鼠连续给药11 d无影响,且随着给药时间的增加,DHA-S在大鼠肝脏内蓄积,雌性大鼠肝脏内含量显著高于雄性大鼠,由此表明在高剂量长期给药的条件下,雌性大鼠对DHA-S更加敏感。Vkorc1在肝脏中表达量较高,在凝血因子Ⅱ、Ⅲ、Ⅸ、Ⅹ合成过程中谷氨酸残基的γ羧化中起重要作用[20],长期给药后雄性大鼠对DHA-S的吸收比雌性大鼠慢,雌性大鼠肝脏中DHA-S浓度较高,PT及APTT也较雄性大鼠更为延长,表明高剂量长期给药下,DHA-S对雌性大鼠的抗凝作用更强,这可能是大剂量长期给药下雌性大鼠更易致死的原因。雌性大鼠肝脏中DHA-S浓度高于雄鼠,可能与不同性别对DHA-S的吸收、分布有关,也可能与不同性别大鼠对DHA-S的代谢存在差异有关,还有待进一步研究。

结果表明200 mg/kg DHA-S灌胃给予大鼠后,PT和APTT的显著延长,可致大鼠凝血异常。雌性大鼠对DHA-S致凝血功能障碍的敏感性高于雄鼠,与DHA-S在不同性别大鼠肝脏中的浓度及对肝脏中VKORC1的抑制有关。