马永杰,赵鹏鹏,龚素华,沈洁娜,张丹辉,靳亚平,雷颖虎*,林鹏飞*

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100;2.秦岭大熊猫研究中心,陕西楼观台 710402)

大熊猫是世界生物多样性保护的旗舰物种,秦岭大熊猫是大熊猫的重要亚种种群,具有独特的形态特征和遗传特性。秦岭大熊猫作为大熊猫的独立亚种,以圆头短尾、憨态圆润闻名于世,极高的观赏价值赋予了秦岭大熊猫特有的“外交使命”,这使得保护秦岭大熊猫亚种独有的遗传多样性成为了新的使命。

据第四次全国大熊猫调查结果显示,秦岭大熊猫约有345只,而其他地区的野生大熊猫约有1519只。从保护大熊猫种群及遗传多样性角度出发,秦岭大熊猫则更为珍贵和濒危。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有明显的集落形成能力、增殖能力、胚胎干性、免疫调节能力及无异基因移植排斥反应与致瘤性等优良生物学特性,在体外培养下间充质干细胞可被诱导分化为多种细胞,是种质资源保护中最有保护价值的细胞资源[1]。快速发展的细胞技术为MSCs在种质资源保存的研究中提供了新方向,同时,MSCs广泛的来源,简单的分离方法,充分显示了其做为种质资源的可行性。目前,MSCs作为优质的种质资源已在牛、猪、小熊猫、北京油鸡等多种动物上展开保护[2-4]。在大熊猫细胞库的建立中,目前仅报道有骨髓与脐带来源的间充质干细胞库、膈肌与皮肤组织来源的成纤维细胞库[5-6],而对大熊猫其他组织来源的MSCs目前尚无研究。本试验通过分离培养秦岭大熊猫不同组织来源的间充质干细胞,经鉴定后对其进行保存,为秦岭大熊猫生命科学基础研究以及今后在再生医学领域中的应用提供珍贵的材料和种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 牙髓、骨髓和脂肪组织来源于陕西省秦岭大熊猫研究中心妊娠106 d的流产大熊猫胎儿。

1.1.2 主要试剂 间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒(HUXMA-90042),成骨诱导分化试剂盒(HUXMF-90021),成脂诱导分化试剂盒(HUXMA-90031),广州赛业生物科技公司产品;RNA Trizol,购自日本Takara公司;反转录试剂盒,加拿大ABM公司产品;CCK-8试剂盒,日本同仁化学(CK04)产品;细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒,上海碧云天公司产品(C0602);0.25%胰蛋白酶,DMSO,美国Sigma公司产品;反转录试剂盒,加拿大ABM公司产品;苏木素,北京索莱宝公司产品。

1.1.3 主要仪器 CO2恒温培养箱(371),分光光度计(Nanodrop One),美国Thermo Fisher公司产品;光学显微镜(101M),日本Nikon公司产品;凝胶成像系统(Tanon 4200),上海天能科技有限公司产品;电泳仪(BG-Power 300),PCR仪(S1000),美国BIO-RAD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 秦岭大熊猫骨髓MSCs的分离 无菌生理盐水冲洗大熊猫流产胎儿3～5次,浸泡于75%酒精60～90 s,用含5×三抗PBS清洗3～5次,置于装有5×三抗PBS的无菌保温瓶中并迅速送至实验室,送至实验室后再次重复以上清洗步骤。

在超净工作台中,用眼科剪和眼科镊取出大熊猫死胎股骨,剪开股骨头暴露骨髓腔;用1 mL注射器吸取DMEM/F12培养液后反复冲洗骨髓腔,收集冲洗液于35 mm培养皿中;将培养皿转移至CO2培养箱,24 h后观察;将未贴壁的细胞移至一新的35 mm培养皿,每日观察细胞贴壁和生长状态。

1.2.2 秦岭大熊猫脂肪MSCs与牙髓MSCs的分离 在超净工作台中,用眼科剪和眼科镊取大熊猫死胎的皮下脂肪组织与牙周组织并剪碎至1 mm3大小,将剪碎的组织块分别转移至10 mL无菌离心管中,加入4～5倍组织体积的5 mg/mL Ⅳ型胶原酶;脂肪组织37℃消化35～45 min,每5 min吹打一次,消化至组织块为絮状物时终止消化;牙周组织37℃消化15 min终止;分别向牙周组织与脂肪组织中加入6～8 mL培养液重悬后,1000 r/min离心4 min,弃去上清;加入DMEM/F12培养液重悬沉淀,转移至各培养皿中,静置1～2 min,待部分未消化组织块贴壁后,缓慢加入DMEM/F12培养液,转移至CO2培养箱中,每日观察细胞贴壁和生长状态。

1.3 秦岭大熊猫MSCs增殖能力检测

将融合度达到80～90%的第3代大熊猫MSCs进行消化并计数,并按照1×104细胞/孔密度接种至96孔培养板中,于37℃、5% CO2培养箱中培养。每日弃去原培养液,加入100 μL新的培养液和10 μL CCK-8工作液,培养箱中孵育2 h后,于酶标仪450 nm波长下检测各孔吸光度,记录并绘制生长曲线。

1.4 秦岭大熊猫MSCs表面标志分子检测

1.4.1 RT-PCR分析 使用Trizol试剂分离总RNA,然后使用5X All-In-One RT MasterMix进行反转录,采用AccuRT Genomic DNA Removal Kit进行PCR检测。根据GenBank公布的大熊猫基因序列,利用Primer 5软件设计引物,序列见表1。

1.4.2 秦岭大熊猫MSCs分化潜能检测

1.4.2.1 脂肪细胞诱导分化潜能检测 成脂诱导分化培养液A的配制:配制前6 h溶解各组分,在175 mL DMEM/F12培养液中加入20 mL FBS、2 mL双抗、2 mL L-谷氨酰胺、400 μL胰岛素、200 μL IBMX、200 μL罗格列酮和200 μL地塞米松,混匀后分装。

成脂诱导分化培养液B的配制:配制前6 h溶解各组分,在175 mL DMEM/F12培养液中加入20 mL FBS、2 mL双抗、2 mL L-谷氨酰胺和400 μL胰岛素,混匀后分装。

培养皿的包被:在24孔细胞培养板的每孔中加入600 μL 0.1%明胶,轻摇使其均匀覆盖底部,1 h后弃去明胶,晾干后即可使用;将融合度达90%的第3代MSCs消化后计数,按照2×104细胞/孔接种于包被后的24孔细胞培养板,每孔加入800 μL DMEM/F12培养液,置于CO2培养箱中培养,每两天观察一次并换液;待细胞融合度达100%时,弃去培养液,PBS清洗两次后,加入700 μL提前预热好的成脂诱导液A;诱导72 h后,弃去成脂诱导液A,加入700 μL成脂诱导液B,诱导24 h后弃去成脂诱导液B;按照上述步骤3和4重复诱导分化4次,直至出现脂滴,停止诱导;弃去诱导液,PBS清洗两次,4%多聚甲醛室温条件下固定30 min,弃去固定液,PBS清洗两次,加入油红O染色20 min,PBS清洗后观察拍照。

1.4.2.2 成骨诱导分化潜能检测 成骨诱导分化培养液的配制:配制前6 h溶解各组分,在175 mL DMEM/F12培养液中加入20 mL FBS、2 mL双抗、2 mL L-谷氨酰胺、2 mL β-甘油磷酸钠、400 μL抗坏血酸和20 μL地塞米松,混匀后分装。将秦岭大熊猫MSCs按照2×104细胞/孔接种于明胶包被的24孔细胞培养板中,加入DMEM/F12培养液后置于CO2培养箱中培养;待细胞融合度达到90%时,弃去培养液加入成骨诱导分化培养液,每3 d换液1次;诱导3周后,弃去成骨诱导分化培养液,PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定,PBS清洗2次,茜素红染色20 min,染色结束后PBS清洗2次,拍照观察。

1.4.2.3 成软骨诱导分化潜能检测 成软骨诱导分化预混液的配制:配制前6 h溶解各组分,在97 mL DMEM/F12培养液中加入1 mL ITS添加物、300 μL抗坏血酸、100 μL脯氨酸、100 μL丙酮酸钠和10 μL地塞米松,混匀后分装。成软骨诱导分化完全培养液的配制:按体积比1∶100在1 mL预混液中加入10 μL TGF-β3配制成完全诱导液。收集1～2×106个秦岭大熊猫MSCs转移至15 mL无菌离心管中,900 r/min离心4 min后,弃去上清并加入1 mL预混液重悬,重复离心并弃去上清;加入1 mL完全诱导液,900 r/min离心4 min后,将离心管的管盖拧松转移至CO2培养箱中;培养48 h后,轻弹离心管底部使细胞沉淀重悬;每隔2～3 d换液1次;持续诱导3～4周后,形成软骨球;将软骨球取出,PBS清洗后,4%多聚甲醛固定30 min;用50%、75%、80%、95%和无水酒精梯度脱水10 min;加入二甲苯和无水乙醇混匀液(体积比1∶1)浸泡2 h后,加入二甲苯浸泡1.5 h,更换二甲苯后继续浸泡1 h;去除二甲苯,加入二甲苯和石蜡混匀液(体积比1∶1),40℃烘箱中放置40 min;将软骨球浸于石蜡中,55℃烘箱放置30 min,然后进行石蜡包埋;石蜡切片后,进行常规脱蜡处理;滴加阿利辛蓝染液,于37℃条件染色1 h,自来水冲洗切片5 min,晾干,显微镜下观察结果。

2 结果

2.1 秦岭大熊猫不同组织来源MSCs形态学观察

2.1.1 骨髓来源MSCs 大熊猫骨髓冲洗液在接种培养后4 d,可观察到MSCs大量迁出(图1a);传代后的第1代MSCs呈长梭形、短梭形以及三角形等形状(图1b);当传代至第4代时,细胞形态均为长梭形,聚集生长呈漩涡状,生长速度加快(图1c);传代至第10代时,MSCs形态呈扁平不规则形状,增殖速度明显下降(图1d)。

a.原代细胞;b.第1代细胞;c.第4代细胞;d.第10代细胞a.Primary cells; b.Cells at the first passage; c.Cells at the 4th passage; d.Cells at the tenth passage图1 秦岭大熊猫骨髓来源间充质干细胞不同代次的形态学特征Fig.1 Morphological characteristics of bone marrow-derived mesenchymal stem cell of Qinling giant panda in different cell passages

2.1.2 牙髓来源MSCs 大熊猫牙髓组织接种后3 d,可观察到组织周围有梭状细胞迁出(图2a);图2b为原代细胞传代后2 d,细胞多呈三角形和多边形,生长较为缓慢;图2c为第4代细胞,细胞呈长梭形,细胞呈现漩涡状生长特点;传代至第8代时,细胞生长速度显著减慢,形态发生变化,部分细胞结构消失,逐渐死亡(图2d)。

a.原代细胞;b.第1代细胞;c.第4代细胞;d.第8代细胞a.Primary cells; b.Cells at the first passage; c.Cells at the 4th passage; d.Cells at the 8th passage图2 秦岭大熊猫牙髓来源间充质干细胞不同代次的形态学特征Fig.2 Morphological characteristics of dental pulp-derived mesenchymal stem cells of Qinling giant panda in different cell passages

2.1.3 脂肪来源MSCs 大熊猫脂肪组织消化接种后7 d时,细胞融合度可达80%以上,细胞多呈长梭形、圆球状,成纤维样细胞聚集现象明显(图3a);原代细胞传代后,此时细胞呈三角形和梭形(图3b);当传代至第4代时,细胞增殖速度加快,细胞形态均一呈漩涡状生长(图3c);第10代细胞增殖能力明显降低,细胞形态不规则(图3d)。

a.原代细胞;b.第1代细胞;c.第4代细胞;d.第10代细胞a.Primary cells; b.Cells at the first passage; c.Cells at the 4th passage; d.Cells at the tenth passage图3 秦岭大熊猫脂肪来源间充质干细胞不同代次的形态学特征Fig.3 Morphological characteristics of adipose-derived mesenchymal stem cell of Qinling giant panda in different cell passages

2.2 秦岭大熊猫不同组织来源MSCs增殖能力分析

采用CCK-8法对第3代骨髓、牙髓和脂肪组织来源MSCs的增殖能力进行检测,如图4所示,3种MSCs在传代后2 d开始迅速增殖,进入对数生长期,5 d时达到平台期,细胞的生长曲线整体均呈现典型的“S”型曲线。

a.骨髓来源间充质干细胞;b.牙髓来源间充质干细胞s;c.脂肪来源间充质干细胞a.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells; b.Dental pulp-derived mesenchymal stem cells; c.Adipose-derived mesenchymal stem cells图4 秦岭大熊猫不同组织来源间充质干细胞增殖能力检测Fig.4 The proliferation ability of mesenchymal stem cell isolated from different tissues of Qinling giant panda

2.3 秦岭大熊猫不同组织来源MSCs表面标志物检测

CD73与CD90为MSCs的特异性标志物,CD31和CD34为造血干细胞的特异性标志物。如图5所示,大熊猫骨髓来源MSCs表达CD73、CD90、SCFR和SOX-2,不表达CD34。大熊猫牙髓来源MSCs表达SCFR、CD90和CD73,不表达CD34和CD31(图5b)。大熊猫脂肪来源MSCs表达CD73、CD90和GNL3,不表达CD34和CD31(图5c)。上述结果表明,本试验分离获得的3种细胞均为MSCs。

a.骨髓来源间充质干细胞;b.牙髓来源间充质干细胞;c.脂肪来源间充质干细胞a.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells; b.Dental pulp-derived mesenchymal stem cells; c.Adipose-derived mesenchymal stem cells图5 秦岭大熊猫不同组织来源间充质干细胞表面标志物检测Fig.5 The surface markers of mesenchymal stem cells isolated from different tissues of Qinling giant panda

2.4 秦岭大熊猫不同组织来源MSCs诱导分化结果

如图6所示,本试验分离获得的骨髓、牙髓和脂肪组织来源MSCs,成脂诱导后可被油红O染为红色,成骨诱导后可被茜素红染为红色,成软骨诱导后可被阿利辛蓝成功染色,表明3种MSCs具有多向分化潜能。

a,d,g.采用油红O染色评估间充质干细胞的成脂诱导能力;b,e,g.采用茜素红染色评估间充质干细胞的成骨诱导能力;c,f,i.采用阿利辛蓝染色评估间充质干细胞的成软骨诱导能力(bar=100 μm);a,b,c.骨髓间充质干细胞;d,e,f.牙髓间充质干细胞;g,h,i.脂肪间充质干细胞a,d,g.The adipogenic induction of mesenchymal stem cells detected by Oil Red O staining; b,e,g.The osteogenic induction of mesenchymal stem cells detected by Alizarin Red staining; c,f,i.The chondrogenic inducibility of mesenchymal stem cells detected by Alicia Blue staining (bar=100 μm);a,b,c.Bone marrow mesenchymal stem cells;d,e,f.Dental pulp mesenchymal stem cell; g,h,i.Adipose mesenchymal stem cells图6 秦岭大熊猫不同组织来源间充质干细胞诱导分化结果Fig.6 Induction differentiation ability of mesenchymal stem cells isolated from different tissues of Qinling giant panda

3 讨论

大熊猫脂肪组织和牙周组织体积较大,本试验通过组织块法和5 mg/mL胶原酶消化法先后处理组织来分离细胞,可加快细胞迁出时间,有效缩短获得原代细胞时间。从大熊猫骨髓、脂肪和牙髓组织中获得的MSCs形态与成纤维细胞相似,当细胞融合度高时呈涡旋状排列,与此前报道过的大熊猫脐带来源MSCs形态相似[7]。本试验中利用MSCs的贴壁特性进行分离纯化,最终获得大熊猫MSCs。

MSCs在体外扩增时会出现衰老及干细胞特性程序性丢失,这可以与MSCs多次传代后缓慢生长和分化能力降低有关[8]。本试验发现大熊猫不同组织来源第3代MSCs传代后2 d进入快速扩增期,6 d达到平台期;骨髓、脂肪及牙髓来源的MSCs在第8～10代时,表现出增殖能力减弱,细胞变为不规则形。

大熊猫MSCs的鉴定受到诸多因素的限制。大熊猫MSCs特异性表面标志物研究较少,相关标准未见权威报道。根据国际细胞治疗协会(ISCT)最低标准,本试验通过诱导细胞分化试验和检测细胞表面标记分子来鉴定是否为间充质干细胞。已有研究表明,未发现大熊猫特异性抗体来测试表面标志物,相关抗体并未商业化[7]。因此,在本研究中,RT-PCR用于检测特定表面标志物的表达。

本试验在骨髓来源MSCs的表型鉴定中,检测结果显示CD73、CD90、SCFR和SOX-2表达阳性,与Yuliang Liu等[9]在大熊猫骨髓MSCs的研究结果基本一致。在脂肪来源MSCs的表型鉴定中,大熊猫脂肪MSCs阳性表达CD73、CD90及GNL3;在人类脂肪MSCs的表型鉴定中,通常稳定表达CD13、CD73、CD44及CD90,CD105表达并不稳定[10]。在牙髓来源的MSCs表面标志检测中,大熊猫牙髓MSCs表达SCFR、CD73和CD90,阴性表达为CD34和SOX-2;在人类牙髓MSCs表型研究中,其表面标志物具有非专一性,可同时表达多种细胞的标志,包括CD73、CD44、CD90和CD105,来自不同组织的MSCs可能表达不同的特异性表面标志物,其分子机制有待研究[11]。

研究表明,MSCs是由具有不同分化特征的异质细胞群组成,从啮齿动物和人类中分离的MSCs可以分化为成骨细胞、神经细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肝细胞[12-14]。在本试验中,大熊猫不同组织来源的MSCs均被成功诱导为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞,表明其具有多向分化的潜能。

本试验通过组织块和酶消化法处理秦岭大熊猫骨髓、牙髓和脂肪组织,获得了各组织来源的MSCs。秦岭大熊猫不同组织来源MSCs表达不同表面标志基因,其中骨髓来源MSCs阳性表达为CD73、CD90、SOX-2和SCFR,阴性表达为CD34;牙髓来源MSCSs表面标志物中阳性表达为SCFR、CD90和CD73,阴性表达为CD34和CD31;大熊猫脂肪来源MSCS表面标志物中阳性表达为CD73、CD90和GNL3,阴性表达为CD34和CD31。对秦岭大熊猫骨髓、牙髓和脂肪来源MSCs诱导分化,结果显示其均具有多向分化的潜能,为大熊猫的种质资源保护与干细胞治疗奠定了种子细胞基础。