王雪艳,李建飞,曹婷婷,刘晓霞,李沛轩,刘丽萍,王雯慧

(甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070)

1963年,科学家首次提出黏膜分泌物中含有免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA),随后Chodirker W B,Tomasi T B在眼泪、胆汁、唾液、初乳和肠道分泌物中证实了这一观点。IgA分为血清型和分泌性(secretory immunoglobulin A,SIgA),由于SIgA在胃肠道黏膜层大量产生,有研究发现SIgA可以明显地与胃肠道内的抗原、毒素、外源性蛋白及微生物结合,以抑制其透过胃肠道黏膜上皮[1,2], 胃肠道SIgA也是调节共生细菌种群的关键[3]。 SIgA通过抑制和控制微生物种群,阻止它们进入肠道免疫系统,从而减少内源性细菌引起的局部炎症[4]。

近年来有学者研究了IgA分泌细胞在鸡、黄牛、猪等不同动物呼吸道黏膜的分布特征[5-7],也有人研究了双峰驼肠道相关淋巴组织(gut associated lymphoid tissues,GALT)中和家兔鼻腔中IgA分泌细胞的分布特征[8-9],宋晨等人研究了SIgA在初生牦牛小肠的分布规律[10],但对于家兔胃肠道黏膜中IgA分泌细胞的分布规律未见报道。本文研究IgA分泌细胞在不同年龄组及同一年龄组不同部位家兔胃肠道黏膜的分布特征,为研究家兔胃肠道黏膜免疫特点提供了相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 经甘肃农业大学动物福利与伦理委员会批准,于兰州大学实验动物中心购买30只家兔,分为3组,即幼年组(2月龄左右)、青年组(5～7月龄)和老年组(36月龄),每组各10只,雌雄各半。

1.1.2 主要试剂 鼠源多克隆一抗IgA (Gene Tex);辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠二抗(Immuno Way);DAB显色液(Immuno Way);TBS缓冲液 缓冲液(Biosharp);高效切片石蜡,上海华申康复器械有限公司产品; 30%过氧化氢、甲醛、甲醇、二甲苯、,国药集团化学试剂有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 KD-TS3A自动组织脱水机,浙江省金华市科迪仪器设备有限公司产品;HistoCore MULTICUT 轮转式切片机,徕卡显微系统上海有限公司产品;KD-H烘片机,浙江省金华市科迪仪器设备有限公司产品;KD-P摊片机,浙江省金华市科迪仪器设备有限公司产品;BX43+SC50正置显微镜带成像系统,Olympus Corporation产品;HY-4H振荡器,常州市金坛大地自动化仪器厂产品。

1.2 方法

1.2.1 采样 实验动物耳缘静脉注射0.1 mL/kg戊巴比妥钠致死,迅速剖检,分别采取胃底腺区、幽门腺区及小肠(十二指肠、空肠、回肠)、大肠(盲肠、结肠、直肠)等不同部位的组织学样品,快速放入50 mL离心管(加30 mL左右的多聚甲醛)中固定12～24 h,期间更换固定液2次。

1.2.2 制作石蜡切片 每只实验动物同一组织部位(例如:胃底腺)随机采取3块组织,置于同一包埋框中,进行梯度脱水,透明、浸蜡、包埋。待蜡块凝固后修块,每个蜡块随机不连续切5张(厚度4 μm)、摊片(温度38℃)、贴片,漓片架控干多于水分放置于烘片机烘片(温度60℃)备用。

1.2.3 免疫组织化学染色 烘干后的切片梯度脱蜡后蒸馏水洗涤2次×3 min;抗原热修复15 min,待自然冷却后,TBS缓冲液洗涤3次×5 min;滴加5% BSA封闭,37℃孵育40 min,甩去多余液体,不洗;滴加稀释好的一抗(1∶200),冰箱4℃孵育过夜(约12 h),取出后室温孵育30 min,TBS缓冲液洗涤3次×5 min;3%过氧化氢室温孵育30 min,灭活内源性生物素酶,TBS缓冲液洗涤3次×5 min;滴加二抗,37℃孵育40 min,TBS缓冲液洗涤3次×5 min;滴加链霉亲和素-生物素复合物(SABC),37℃孵育30 min,TBS缓冲液缓冲液洗涤3次×5 min;室温避光滴加DAB显色液(现配现用),在光学显微镜检测下显色,以防显色过度,蒸馏水洗涤2次×3 min;苏木精轻度复染(约30 s),酒精逐级脱水及二甲苯透明、中性树胶封片,并在显微镜下观察染色结果。

阴性对照组中,用TBS缓冲液代替一抗,其余条件和步骤同阳性组织。

1.2.4 结果观察与数据统计分析 将每个组织蜡块切片共计15张,在BX43+SC50 正置显微镜带成像系统中仔细观察,每张切片中随机选取3个视野照片采集(×100)。用Image-Pro Plus软件对每个图片可见视野内的IgA分泌细胞进行数量统计。然后使用IBM SPSS statistics 20.0软件对试验得到的数据进行单因素方差分析,结果表示为“平均值±标准差”,P>0.05表示差异不显著,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。 在Origin Pro 9.1中绘图。

2 结果

2.1 IgA分泌细胞在胃黏膜中的分布特点

IgA分泌细胞在胃底腺和幽门腺区主要散在分布于黏膜固有层腺体周围,IgA分泌细胞主要呈椭圆形,细胞核呈圆形,明显偏于一侧,阳性反应产物主要位于胞质内(图1)。

A、B、C.分别为幼年组、青年组和老年组的胃底腺区;D、E、F.分别为幼年组、青年组和老年组的幽门腺区。(IHC-P×1000)A,B,and C.The fundic gland areas in the juvenile,young,and elderly groups,respectively;D,E and F.The pyloric gland areas in the juvenile,young and elderly groups,respectively.(IHC-P×1000)图1 IgA分泌细胞在胃黏膜中的分布特征Fig.1 Distribution characteristics of IgA secreting cells in the gastric mucosa

对胃底腺区和幽门腺区IgA分泌细胞数量统计分析可得:青年组胃底腺区IgA分泌细胞数量与幼年组和老年组差异极显著(P<0.01),幼年组和老年组相比差异不显著(P>0.05);幽门腺区青年组、幼年组和老年组相比差异不显著(P>0.05)(图2)。

同一柱形代表同一年龄组,**为差异极显著(P<0.01)The same bar represents the same age group,and ** is highly significant difference(P<0.01)图2 不同年龄组胃底腺区和幽门腺区IgA分泌细胞数量Fig.2 Numbers of IgA-secreting cells in the fundic and pyloric gland regions in different age groups

2.2 IgA分泌细胞在小肠黏膜中的分布特征

IgA分泌细胞在小肠中主要呈椭圆形,细胞核呈圆形,明显偏于一侧,阳性反应产物主要位于胞质内。在十二指肠和空肠主要成群分布于黏膜固有层的结缔组织,在回肠则散在分布于黏膜下层的肠腺周围(图3)。

A、D、G.分别为幼年组十二指肠、空肠、回肠;B、E、H.分别为青年组十二指肠、空肠、回肠;C、F、I.分别为老年组十二指肠、空肠、回肠。(IHC-P×1000)A,D and G.The duodenum,jejunum and ileum of the juvenile group,respectively;B,E,and H.The duodenum,jejunum,and ileum of the youth group,respectively;C,F,and I.The duodenum,jejunum,and ileum of the elderly group,respectively.(IHC-P×1000)图3 不同年龄组小肠黏膜中IgA分泌细胞特征Fig.3 Characteristics of IgA-secreting cells in the small intestinal mucosa of different age groups

对小肠IgA分泌细胞数量统计分析可得:青年组十二指肠IgA分泌细胞数量与幼年组和老年组相比差异极显著(P<0.01),幼年组和老年组相比差异显著(P<0.05);青年组空肠IgA分泌细胞数量显著高于幼年组和老年组(P<0.05),幼年组和老年组相比差异不显著(P>0.05);青年组回肠IgA分泌细胞数量显著高于幼年组和老年组(P<0.05),幼年组和老年组相比差异不显著(P>0.05)(图4)。

同一柱形代表同一年龄组,**为差异显著(P<0.01)*为差异显著(P<0.05)The same bar represents the same age group,and * * is extremely significant difference(P<0.01),* is significant difference(P<0.05)图4 不同年龄组小肠黏膜IgA分泌细胞数量Fig.4 Numbers of IgA secreting cells in the small intestine in different age groups

2.3 IgA分泌细胞在大肠黏膜中的分布特征

IgA分泌细胞在大肠主要呈椭圆形,细胞核呈圆形,明显偏于一侧,阳性反应产物主要位于胞质内。IgA分泌细胞在幼年组和老年组的盲肠和结肠中主要散在分布于固有层肠腺周围,而青年组主要成群分布于黏膜固有层的结缔组织中。IgA分泌细胞在直肠中均散在分布于固有层肠腺周围(图5)。

A、D、G.分别为幼年组盲肠、结肠、直肠;B、E、H.分别为青年组盲肠、结肠、直肠;C、F、I.分别为老年组盲肠、结肠、直肠。(IHC-P×1000)A,D,and G.The cecum,colon,and rectum of the juvenile group,respectively;B,E,and H.The cecum,colon,and rectum of the youth group,respectively;C,F,and I.The cecum,colon,and rectum of the elderly group,respectively.(IHC-P×1000)图5 不同年龄组大肠黏膜IgA分泌细胞特征Fig.5 Characteristics of IgA-secreting cells in the large intestine mucosa of different age groups

对大肠IgA分泌细胞数量统计分析可得:青年组盲肠IgA分泌细胞数量显著高于幼年组和老年组(P<0.05),幼年组和老年组相比差异不显著(P>0.05);青年组结肠IgA分泌细胞数量与幼年组和老年组相比差异极显著(P<0.01),幼年组和老年组相比差异显著(P<0.05);青年组直肠IgA分泌细胞数量与幼年组差异极显著 (P<0.01),和老年组差异显著(P<0.05),幼年组和老年组相比差异显著(P<0.05)(图6)。

同一柱形代表同一年龄组,**为差异极显著(P<0.01)*为差异显著(P<0.05)The same bar represents the same age group,and * * is extremely significant difference(P<0.01),* is significant difference(P<0.05)图6 不同年龄组大肠黏膜IgA分泌细胞数量Fig.6 Numbers of IgA secreting cells in the large intestinal mucosa in different age groups

2.4 不同年龄组胃、小肠、大肠黏膜IgA分泌细胞数量趋势

在不同年龄组胃、小肠、大肠黏膜等不同部位中IgA分泌细胞数量以十二指肠部位最多,整体呈现出先增高后降低的趋势(图7)。

同一线形代表同一年龄组The same line represents the same age group图7 不同年龄组胃、小肠、大肠黏膜中IgA分泌细胞趋势Fig.7 Trends of IgA-secreting cells in the mucosa of the stomach,small and large intestines in different age groups

3 讨论

本研究发现:IgA分泌细胞数量在幼年组、青年组和老年组均呈现出小肠黏膜分布最多的特点,而小肠中主要分布在十二指肠。Pabst,Oliver等人研究得出:肠道是机体内黏膜浆细胞数量分布最多的部位[11]。Seikrit C,Pabst O等人研究发现IgA是小鼠和人体内产生最多的抗体[12],大多数分泌IgA的浆细胞局限于黏膜组织,尤其是肠道[2]。Brandtzaeg P,Johansen FE等人研究发现人体中大约80%的浆细胞来源于肠道相关淋巴组织(Gut associated lymphoid tissues,GALT),它们所产生的SIgA比所有其他免疫球蛋白的总和还要多[13]。我们的研究结果和以上研究基本一致。SIgA是位于肠道的主要免疫效应产物之一,不仅可以影响肠内微生物种群的组成,并且还可以抵御轮状病毒等肠道病原体。SIgA作为肠黏膜的一线保护屏障,其在调节宿主免疫生理稳态中也起着关键作用[14]。根据以上研究我们可以推测SIgA在家兔小肠中也可以发挥同样作用。

本研究发现家兔青年组胃、小肠、大肠黏膜中IgA分泌细胞数量高于幼年组和老年组,其可能原因有以下几个观点:第一,与胃肠道相关淋巴组织的发育有关,因为胃肠道相关淋巴组织是IgA分泌细胞产生的主要场所[15];第二,外界抗原的诱导。宿主的免疫系统会相互影响微生物种群的组成[16],这样一个过程可能被认为是宿主的SIgA与其肠道微生物种群的相互影响。第三,T细胞非依赖性途径。 因为青年组胃肠道相关淋巴组织已经发育成熟,幼年组处于正发育阶段,而老年组机能处于退化阶段。青年组和幼年组比较,抗原侵袭的频率和种类更多。但这一观点不能合理的解释青年组IgA分泌细胞数量高于老年组的原因。至于胃黏膜中各年龄段IgA分泌细胞数量均表现为幽门腺区高于胃底腺区,推测可能是受到胃PH值及微生物数量及种类的影响。而大肠中盲肠IgA分泌细胞数量最多的原因可能是由兔子特有的圆小囊结构所决定的。

4 结论

本研究采用石蜡组织切片和免疫组织化学方法对健康家兔的幼年组(2月龄)、青年组(5～7月龄)及老年组(36月龄)胃肠道黏膜中中IgA分泌细胞分布特征进行染色观察,并对分泌细胞数量统计分析。IgA分泌细胞数量在3个不同年龄组中均呈现出十二指肠分布最多。青年组胃肠道中IgA分泌细胞数量高于幼年组和老年组。同一年龄组中胃、小肠、大肠呈现出先升高后降低的趋势。本试验结果将为研究胃肠道相关淋巴组织IgA分泌细胞提供理论性支持。