陈俊，刘家麒

1.上海市食品研究所有限公司（上海 200235）；2.上海微谱检测认证有限公司（上海 200441）

近年来，新型细菌检测工具的变革和发展不断进行，把繁重复杂的科学工作逐渐由智能仪器替代完成。聚合酶链反应（PCR）是常用的检测细菌细胞的生物学方法之一。PCR对于仪器技术的发展也有帮助，因为其对各种微生物的检测具有敏感性[1]。研究发现，分子生物学、免疫学技术等各种新技术，这些细菌检测技术在灵敏度和准确性方面也都得到很大的提升。本文主要论述在食品技术、食品检测和微生物学等领域中出现新趋势及其实际应用，同时介绍传统的和现代的细菌检测技术。相比传统的检测方法，现代化新型检测技术具有灵敏度高、高效、数据准确的优势。

1 传统生物检测技术

1.1 依赖培养的微生物学方法

生物培养依赖的方法往往耗时长，器械要求高，需要艰苦的劳动。通常需要一个漫长的过程，需要进行样本采集、选择合适的媒体和等待适当的培养时间，检测潜伏期细菌病原体需要18～24 h。在测定细菌的生长速率和杀灭速率时，测定样品中活菌的数量是很重要的指标。单个菌落由从一个细胞或一组细胞开始的细菌细胞繁殖组成，每个样本中细菌的这种定量常称为菌落形成单位总数（CFU）。只有在控制条件下即培养温度、培养时间、选择培养基和氧利用度下可培养的细胞才能被计数。鉴定复杂样品中的细菌和病毒在疾病诊断、产品安全和研究中是非常重要的。基于序列的检测方法已被证明是有用的，并且可以在一次分析中以合理的成本，检测已测序的数千种微生物中的任何一种。

1.2 非培养生化检测技术

在检测技术中，检测设备和检测方法一开始从传统基于培养的鉴定方法发展到现在代基于抗原和蛋白质检测的系统，进一步扩展到快速进行分子检测鉴定。准确快速地鉴定微生物制剂是临床诊断和食品微生物学的主要目标。传统上，从水、废水和其他环境样品中检测病原体的能力，受到从复杂的环境样品中培养生物体的能力的限制。

1.3 基于核酸序列的免疫检测技术

免疫学和核酸序列检测技术被认为是微生物学中最强大的技术。其中，变性梯度凝胶电泳是一种利用化学梯度使样品（核酸）在丙烯酰胺凝胶上移动的电泳技术。该技术通常被用于分离聚合酶链反应并从中获得大小相同但具有不同的变性能力的基因，肠道沙门菌和鼠伤寒沙门菌是全世界范围内最广泛的沙门菌疾病和胃肠道疾病的病原体。对它们进行简单、灵敏的检测对生物安全及现场诊断具有重要意义[2]。基于核酸的检测方法主要是围绕所有沙门菌的肠道成员16S rRNA基因，这是一种简单、灵敏、快速的检测方法[3]。然而，由于16S rRNA序列同源性高，因此特异性区域少，对此研究人员开发一种新的核酸依赖性扩增检测（NASBA）方法，称为单特异性引物NASBA，其中的特异性反义引物足以进行特定的NASBA反应。设计针对16S rRNA可变区段的高特异性反义引物和简并引物，用设计的引物在单一反应环境中同时特异性检测两种病原体，并且检测限小于10 CFU/mL。开发的NASBA分析方法应该有助于整个检测过程，并且用于在各种情况下（如疾病暴发）的病原体检测。微生物检测阵列（MDA），已被用于检测所有已知的病毒（包括噬菌体）、细菌和质粒，并开发一种用于从杂交该阵列的复杂样本中识别微生物混合物新的统计方法。应用家系特异性探针可以对所有已定序的病毒和细菌全基因组、片段和质粒进行检测。设计的探针能够允许一些序列发生变异，从而能够检测出与被测序生物体具有同源性的不同物种，并且与人类基因组序列没有显著的匹配。在用单个或多个病毒刺激的样本进行盲法检测时，MDA能够正确识别物种或菌株。在临床粪便、血清和呼吸样本中，丙二醛检测方法是常用的能够检测和鉴定样本中具有多种病毒、噬菌体和细菌的技术，并通过PCR得到证实。结论证明丙二醛可用于鉴别复杂样品中是否存在的病毒和细菌。

2 现代生化检测技术

2.1 生化特性

各种常规的观察和生化方法被用于检测细菌，微生物学家可通过琼脂板上的菌落对细菌进行检测。细菌因其细胞壁结构和组成的不同可分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。其他化学特性也对细菌鉴定起着重要作用，如糖发酵、酶的产生和耐药等，这些都可以很容易地检测出来。有几种生化测试可以对任何细菌完成鉴定，如淀粉水解、明胶水解、酪蛋白水解、过氧化氢酶活性、脱氮试验、硫化氢的生产、细菌样品的碳源利用谱等。基于核酸序列的检测技术比上述生化方法更容易、更可靠，已成为标准和直接的方法。

2.2 免疫检测技术

免疫学方法是建立在抗体与抗原特异性结合基础上进行的检测。在食品调查中广泛使用的免疫学方法是酶联免疫吸附法（ELISA）[4]。它可以检测花生中黄曲霉毒素。另外已有研究将酶联免疫吸附试验与放射免疫测定、免疫扩散、免疫荧光、血凝和免疫电泳进行比较。研究结果表明，酶联免疫吸附法是目前应用于蛇毒研究领域的最通用的免疫分析技术，其优点主要包括具有相对较高的灵敏度和样品采集的简便性。它适用于大规模流行病学研究和准确地诊断蛇咬伤。酶联免疫吸附试验有助于提高对血吸虫病的流行病学知识，其使用抗体和识别颜色变化的物质包括酶联荧光试剂和免疫磁珠分离（IMS），可以有效检测从各种样本中培养的细胞，它可用于量化食物、血液或粪便样本的致病菌。ELISA是食品诊断中最通用的免疫分析方法。商用ELISA试剂盒主要应用于食源性微生物诊断。为开发更灵敏的方法，将ELISA和免疫磁珠结合起来，并用荧光团标记，用于细菌的视觉检测。免疫层析法（如侧流式免疫分析法）在目标颗粒向固定化抗体迁移过程中表现出良好的视觉检测效果。侧流式免疫层分析法和磁浓度法在2 h内可检测出在奶样品中添加单核增生乳杆菌浓度。ELISA是一种经济有效的免疫分析方法，可替代简单的显微镜法（廉价法）和高效液相色谱法（昂贵法）。

3 生物传感器

3.1 电化学生物传感器

电化学生物传感器是一种基于化学修饰石墨烯（传感器的换能器层）和适配体（传感层）的电位型适配传感器。氧化石墨烯和还原氧化石墨烯是构建两种适配传感器的基础，用于检测具有挑战性的生物，如金黄色葡萄球菌[5]。在这2种适配传感器中，DNA适配体要么共价的，要么非共价，可附着在换能器层上。在这2种情况下，都能在分析中选择性地检测到单个金黄色葡萄球菌，尽管用还原氧化石墨烯制造的噪音水平低于氧化石墨烯制造。但这些新的适配体具有很高的选择性，其特点是技术简单和用于构建的材料易于获得，同时在非常短的时间内对微生物的检测提供极低的检测限。

3.2 光学生物传感器

光学生物传感器在性能上具有很高的选择性和敏感性，为快速检测致病菌和各种毒素提供方便。它们具有低检测限、高输出筛选、实时分析等特点。纳米生物技术已得到开发及应用，通过整合生物传感器周围的各种信号实现对细菌的常规检测。光学生物传感器被认为是检测细菌中最聪明的方法，通过对纳米孔阵列的堵塞作用与特定的细菌抗体结合，从而检测单个细菌细胞，近年来SPR（表面等离子共振）生物传感器与磁性分离方法相结合，使用金包裹磁性纳米颗粒检测各种病原菌。SERS（表面拉曼增强光谱）方法被用于多种病原体的高选择性检测，为开发自动组合和微型化方法已开展大量工作，如核酸序列扩增和环介导等温扩增，同时设计多壁板微流控装置，实现对水中病原体的多重可视化检测。

4 细菌检测的仪器技术

4.1 流式细胞术

流式细胞术（FCM）是一种生物诊断工具，可以检测和计数食品和食品加工过程中的微生物种群。FCM可以提供有关细胞生理状态的信息，并允许在混合培养中计数微生物。因此，这项技术越来越多地被用于定量病原体和腐败微生物检测。FCM在葡萄酒领域中的应用大幅增加，可用于确定微生物在酒精发酵和苹果乳酸发酵过程中的数量和生理状态。基于流式细胞术的应用可用于检测各种牛奶样品中的革兰阳性和革兰阴性细菌。该技术可为奶农和兽医提供关于革兰菌类型的现场信息，同时防止乳腺炎病例中不需要的抗菌治疗。流式细胞术应用已被用于研究水样的细菌学评估和检测有害和不可培养的细菌[6]。

4.2 气相色谱和质谱分析

分析挥发性化合物是分析化学中的一种常见做法，通常用于分析混合物中化合物纯度的测试和鉴定。此外，它可用于制备色谱，并从各种化合物的混合物中制备纯物质。气相色谱和质谱等仪器技术已被用于分析细菌化合物的微生物鉴定系统。气相色谱质谱联用技术（GC-MS）是一种有效的细菌及其化合物的鉴定和检测手段。新的微型化技术，如GC-DMS（气相色谱微分移动光谱法）被用于检测大肠杆菌等大肠菌群，这2种技术GC-MS和GC-DMS可以检测细菌细胞释放的各种化合物（如邻硝基酚和吲哚）。

5 光谱技术

5.1 傅里叶变换红外光谱（FTIR）

FTIR是一种基于红外光谱的技术，适用于MIR。利用傅里叶变换红外光谱技术对新鲜肉糜中的生化变化进行测定，可以达到快速监测牛肉腐败的目的[7]。把绞碎的牛肉从新鲜到腐败的红外光谱进行测量收集，并进行可行的计数，主成分分析可以阐明波数可能与腐败过程有关。研究结果表明，FTIR不受储存条件（如包装和温度）的限制，FTIR光谱可以通过制作代谢指纹图谱完成检测，该方法与化学计量学相结合，是一种强大、快速、经济、无创的监测肉糜新鲜度的方法。FTIR光谱被认为是一种快速、准确检测肉制品中食源性致病菌的生化指纹技术。通过红外光束与被激发分子的振动相联系的，由此产生的吸收光谱代表一个特定的指纹，这是任何生化或化学物质的特征。这项技术可以用来测量食物内部发生的生化变化，提供有关的信息，了解食物中的微生物代谢物的腐烂和形成。

5.2 拉曼光谱技术

拉曼光谱是一种光谱技术，在给定的系统中使用振动、旋转和其他低频模式进行检测。它利用了激光在一定范围内弹性散射的效应与样本分子之间的相互作用。利用拉曼光谱技术结合化学计量学方法对冷冻猪肉的脂质氧化程度进行快速检测研究，结果发现冷冻猪肉过氧化值与贮藏时间具有显著相关性，采用拉曼光谱技术可以快速测定冷冻猪肉的酸价和过氧化值[8]。用测试样本挑战这个数据库。在食品和医学中，拉曼光谱可作为检测完整的细菌细胞的有效工具，同时可以在几秒钟内记录光谱，利用各种统计工具在几分钟内生成结果。科学家正试图通过将光谱技术与纳米阵列相结合，寻找检测食品中食源性致病菌的创新方法，以获得更好的结果。

5.3 太赫兹辐射技术

太赫兹（THz）辐射也被称为太赫兹波和太赫兹光，THz辐射主要用作成像工具，研究半导体等离子体天线表面细菌层间之间的相互作用，THz等离子体天线提高生物材料薄膜的灵敏度极限，使细菌的检测降低到单层厚度[9]。此外，还可在5种不同的细菌中选择性地鉴定革兰菌类型。这种选择性可以从对双层细菌的实验和对单层细菌的多重测量分析中看出。革兰体之间信号差异的来源很可能是来源于细胞壁的结构差异或菌体内物质的不同含量。可使用统计方法（如化学计量学或分类算法）确定未知样本的菌种类型，THz作为一种无标签、低成本、快速的探测和接收技术，也可用于快速检测抗生素疗效等方面。科学家设计各种可携带、无标签和灵敏的技术，可用于现场微生物调查，THz辐射就是其中之一。尽管THz光谱技术被认为是一种很有前途的检测技术，但它仍然面临一些局限性。局限性与太赫兹波长和细菌细胞大小不匹配有关。可通过使用THz超材料和增加细菌与太赫兹辐射相互作用来克服这一问题，从而提高THZ辐射的灵敏度，使之与细菌细胞更加兼容。此外，THz技术与化学计量学和其他统计工具相结合，可以提供更多的自动化和无偏结果。利用高质量的THz系统、高效的超材料及其他有效的统计工具，可提供更具潜力的细菌检测应用平台[10]。

6 结语

微生物通常存在于食物、水、土壤、空气中，甚至存在于动物和人体中，并不是所有微生物都是致病菌。有研究提出一种新颖的现场检测方法，这种方法不依赖于培养，简单而且经济：将实时酶传感器和酶响应纳米等离子体生物传感器系统，应用于细菌的特异性和选择性检测。传统的检测技术主要用于检测水、食品等样品中的细菌和微生物，而这些技术限制来自复杂环境样品中不可培养的微生物信息。通常，新的诊断方法结合各种仪器，具有高度的先进性。大多数技术是基于免疫学检测和电子传感器进行检测。传统检测技术虽然足够灵敏、准确，但往往速度慢、耗时长。在过去的几十年里，人们做了大量的工作来改进和发展先进的探测技术。传统和常规的检测技术虽然相当准确和可靠，但无法检测细菌细胞的生存状态。一些现代仪器提供关于快速检测计数的细菌细胞生理状态的详细图像。分子动力学、化学计量学和许多其他检测方法克服相关局限性，为这些新兴的检测技术提供跨学科和前沿的科学支持，促进科学技术的发展。本文介绍了传统和现代的细菌检测技术，也可以看出现代新型检测技术具有快捷、准确的优势，如果以后的研究中能够将检测成本进行优化控制，那么更好、更快捷的新型技术一定能取代传统方法，并得到广泛运用。