谢佳芮，寇美玲，高华峰，高林，陈文瑾，苗海生

(云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224)

阿卡斑病 (Akabane disease)又名赤羽病，是由阿卡斑病毒(Akabane virus，AKAV)引起的一种病毒病，主要感染牛羊，以流产、早产、死胎、胎儿畸形、木乃伊胎、新生胎儿发生关节弯曲和积水性无脑综合征(AH 综合征)为特征，主要传播媒介为吸血昆虫。阿卡斑病毒隶属泛布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)、正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)、辛波血清群(Simbu)，是单股负链RNA病毒。该病毒最早于1959年在日本群马县赤羽村的金色库蚊和三带喙库蚊体内分离获得，其后在韩国、台湾、土耳其、以色列及澳大利亚先后发现该病毒，其中2002—2006 年间在日本发生14次疫情，给日本牛羊养殖业造成严重的损失[1-4]。我国云南、广西、陕西、内蒙古、湖南、河北、山东、上海、吉林等地区也相继检测或分离到该病毒[5-7]。

阿卡斑病与其他多数病毒病一样，无特效治疗药物，主要通过接种疫苗进行防控，但由于多数动物感染后临床症状不明显，因此极易造成误诊，被发现时往往已成大流行态势。目前，国外已开发出多种弱毒苗和灭活苗，减毒活疫苗已在日本使用，灭活疫苗已在澳大利亚、日本和韩国使用。日本开发了利用HmLu-1细胞传代致弱的减毒活疫苗，但是该疫苗用本国毒株制备[8]，对中国流行毒株的免疫效果无评价结果。目前，国内未见有商品化阿卡斑疫苗批准和相关研究报道，因此亟需针对我国流行毒株开发安全、高效的疫苗。本研究应用3种细胞分别对阿卡斑病毒CX-01株进行培养，应用BEI灭活剂进行灭活，评价病毒增殖滴度，探索灭活程序，并利用小鼠模型评价了ISA 206佐剂灭活疫苗的免疫效力。

1 材料与方法

1.1 阿卡斑病毒毒株培养及组织半数感染量(TCID50)检测

阿卡斑病毒CX-01株于2019年分离自云南省楚雄州一羊场，由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室鉴定保藏，同时保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为：CGMCC No.45207，可适应BHK-21、Vero和HmLu-1细胞培养。扩繁病毒时，首先将细胞培养瓶中长满单层的BHK-21、Vero和HmLu-1细胞接种适量的阿卡斑病毒种毒，再补加MEM维持液，以种毒和MEM维持液混合后病毒的初始滴度不低于104.5TCID50/mL为准，置37 ℃温箱培养，当观察到70%～80%细胞病变效应 (CPE)时收获病毒培养液，冻融1次后，3 000 r/min离心30 min，上清液即为制备灭活疫苗的病毒液，进行TCID50检测。

TCID50检测方法：将待检病毒液用无血清MEM培养基作10-1～10-6连续倍比稀释，加入提前准备长满上述相应细胞的96孔培养板内，每个稀释度加4孔，每孔0.1 mL，然后每孔补加0.1 mL无血清MEM培养基，置5%二氧化碳37 ℃温箱中培养。5 d后观察细胞病变，Kärber法计算TCID50。

1.2 主要试剂和实验动物

主要试剂：BEA(二乙烯亚胺)、氢氧化钠、硫代硫酸钠、MEM培养液、胎牛血清、ISA 206佐剂、分析纯左旋咪唑盐酸盐，购自云南丰科生物科技有限公司。蔗糖、海藻糖购自昆明诺华生物科技有限公司。实验动物为BALB/c小鼠，购自昆明医科大学实验动物中心，小鼠实验在云南生物制药有限公司实验动物中心进行。

1.3 病毒增殖特征

应用已经适应HmLu-1、Vero、BHK-21细胞的阿卡斑病毒CX-01种毒，分别接种3种细胞测定病毒增殖规律，以确定病毒在不同传代细胞上的增殖特性。将上述3种细胞培养的种毒分别作病毒滴度(TCID50)检测，并用无血清MEM培养基进行稀释，使培养液内的病毒最终滴度为104.5TCID50/mL，分别加入到对应长满单层细胞的HmLu-1、Vero、BHK-21细胞培养瓶中，置37 ℃温箱中培养。分别在培养0、12、24、36、48、60、72、84、96、108和120 h取样，每次取样0.5 mL，同时补加0.5 mL的无血清细胞培养液。取样完成后分别用HmLu-1、Vero、BHK-21细胞对相应细胞培养的病毒样品进行TCID50检测。

1.4 病毒灭活

制备0.2 mol/L的BEI灭活剂，具体方法为：在1.6%氢氧化钠溶液中加入4.1%的二乙烯亚胺，充分溶解，置37 ℃ 1.5 h进行环化，期间每15 min剧烈晃动10 s，反应结束后即得到0.2 mol/L的BEI灭活剂，现用现配，共制备3个批次。将病毒滴度106.75TCID50/mL的病毒液平均分为3份，每份30 mL。首先将3批次待灭活的病毒悬液置37 ℃水浴锅中，使病毒液温度达到37 ℃，然后将0.2 mol/L BEI灭活剂按照1%的量加到病毒液中，即BEI终浓度为0.002 mol/L，置37 ℃温箱中缓慢搅拌灭活。分别在灭活0、1、2、3、4、5、6、7和8 h时各取样5 mL，并添加2 mol/L的硫代硫酸钠溶液10 μL到样品内，终止灭活反应，4 ℃保存待检。所有样品用无血清MEM培养液分别作10-1～10-6倍比梯度稀释，进行TCID50检测。

1.5 不同疫苗添加剂对免疫效果的影响

将灭活好的阿卡斑病毒液分为4份，每份10 mL。为评估疫苗添加剂蔗糖、海藻糖和左旋咪唑对小鼠免疫效果的影响，试验设4个不同添加剂配方组别：第1组为10 mL病毒；第2组为10 mL病毒液+0.5 mL蔗糖+0.5 mL海藻糖；第3组为10 mL病毒液+0.5 mL蔗糖+0.5 mL海藻糖+1%左旋咪唑(0.11 g)；第4组为10 mL病毒液+1%左旋咪唑(0.1 g)；第5组为对照组，为HmLu-1细胞培养上清液。然后按照体积比1∶2的量加入ISA 206佐剂搅拌乳化，4～6 ℃放置30 d后进行疫苗免疫试验。每种疫苗接种5只小鼠，每只小鼠皮下接种0.2 mL，21 d后心脏采血分离血清，进行中和抗体检测。

中和试验方法为：在96孔细胞培养板上将待检血清作1∶4～1∶512倍比稀释，应用100 TCID50的病毒液在5%二氧化碳37 ℃温箱中进行中和反应1 h，然后以HmLu-1细胞作为感作细胞，每孔加100 μL细胞生长液(约含1×104个细胞)，5%二氧化碳、37 ℃温箱培养5 d后判定结果，Kärber法计算中和抗体效价。

1.6 数据统计分析

利用SSPS软件进行单因素方差分析，多重比较检验，数据以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 病毒培养和毒价检测

阿卡斑病毒滴度(TCID50/mL)检测结果见表1。结果显示，HmLu-1、Vero、BHK-21细胞均在84～96 h时滴度最高，其中HmLu-1细胞培养病毒滴度最高为106.75TCID50/mL。

表1 3种细胞扩繁病毒滴度检测结果-lg TCID50/mL

2.2 病毒灭活时间确定

用终浓度为0.002 mol/L的BEI对3个批次的病毒液进行灭活、取样，每次取样后加终止液终止反应。表2结果显示，3批次抗原在灭活5 h后TCID50均为0，即病毒液不再感染细胞。为确保对阿卡斑病毒的灭活完全彻底，在BEI灭活剂用量和灭活条件不变的前提下，选择最优的灭活时间即8 h，其中第5小时后更换灭活用容器(瓶)1次。

表2 不同灭活时间TCID50检测结果-lg TCID50

2.3 免疫效果评估

中和试验结果显示(见表3)，1～4组均不同程度出现中和抗体，对照组(5组)未出现中和抗体。其中第3组免疫效果最好，平均中和抗体滴度为18.0，极显著高于第1组(P<0.01)，显著高于第2组和第4组(P<0.05)。表明阿卡斑病毒灭活后需添加蔗糖、海藻糖、左旋咪唑稳定抗原并提高机体对抗原的免疫应答。

表3 阿卡斑病毒灭活疫苗不同添加剂免疫效果比较

3 讨论

随着赤羽病在世界许多地区的广泛流行，病毒基因组和致病性也在不断演化，在韩国、日本和台湾已发现变异株，其对犊牛和成年牛的致病性增强，并可引起新生犊牛脑炎症状[9]。2016年在广西发现可以感染竹鼠的致病性毒株[10]，2021年9月至2022年1月，我国东北地区多地发生疑似阿卡斑病毒致病的疫情[11]。云南省畜牧兽医科学院应用cELISA方法对2019—2020 年采自云南省边境地区10个县市的牛群血清样品进行AKAV 抗体检测与分析，结果在采集的4 437份牛血清样品中检出抗体阳性样品1 367 份，平均抗体阳性率为30.81%[12]。

本研究选用的毒株为2019年分离自山羊血液的CX-01毒株，通过对S和M基因片段的比较，该毒株属于基因群Ia，与所有中国已报道毒株序列属同一遗传谱系，并且该毒株易持续性扩繁，因此该毒株作为中国疫苗用毒株具有一定的优势。目前国外已有阿卡斑病毒灭活疫苗制备的报道[13-15]，Yang等[15]用BEI和甲醛分别对阿卡斑病毒灭活，制备疫苗后接种豚鼠和怀孕母牛，发现2种灭活方法对免疫效果无显著差异，一次免疫后抗体效价高于8，二次免疫后最高中和抗体效价均可达64 。由于甲醛主要是通过病毒衣壳蛋白的交联反应使蛋白质变性阻止核酸的释放，BEI则直接破坏病毒核酸，避免了破坏衣壳表面抗原和病毒返强，选择适当的用量可在5 h内灭活病毒，保证了病毒衣壳蛋白的稳定性。同样规格的BEI灭活剂，不同厂家或不同批次不可避免的存在纯度、活性方面的细微差异，在灭活剂配制过程当中由不同人员操作也会有差异。本研究中使用的温箱与其他研究人员使用的温箱或温室可能会存在温度上的差异，并且病毒液用量不同时，特别是大容量培养时温度传导较慢，影响灭活效果。作者曾长期开展口蹄疫等重大动物疫病灭活疫苗研究，比如口蹄疫病毒一般37 ℃ 6 h可完全灭活，但实际生产过程中均需要12 h以上来确保安全。因此，适当延长病毒的灭活时间是灭活疫苗制备常识，虽然阿卡斑病非重大动物疫病，但适当的延长病毒灭活时间也是必要的，综合考虑灭活效果与病毒稳定性的关系，确定灭活8 h比较合理。本研究选择了该种灭活方法进行研究，为阿卡斑病毒灭活疫苗制备提供了一种新的灭活方案。由于受研究条件限制，选择了BALB/c小鼠作为动物模型进行试验，虽然不能完全体现大动物的实际免疫效果，但是在一定程度上可展示出灭活疫苗和添加剂的作用，为后续试验提供参考。研究中，蔗糖和海藻糖作为抗原保护剂已得到了共识，左旋咪唑作为一种免疫调节剂，能够促进抗体的产生，增强T细胞的活化和增殖，增强单核巨噬细胞的吞噬功能[16]，本研究是对其增强抗体分泌功能的一种尝试性使用，至少证明在阿卡斑病毒灭活疫苗中配合使用是有突出效果的。

阿卡斑病毒在我国多地特别是热带亚热带地区呈现流行性分布，目前已有毒株致病力普遍较弱，多数动物在感染6 d后转归良好，但随着病毒基因组的不断变异和重组，不排除未来高致病性毒株的出现，因此对毒株和灭活疫苗制备技术的研究具有重要意义。